水通道蛋白（AQP）是一组介导水跨膜转运的细胞膜转运蛋白，在目前已经鉴定出的6种肺AQP中，分布于下呼吸道的主要有水通道蛋白1（AQP1）与水通道蛋白5（AQP5）^[1]。AQP1和AQP5在肺部水液代谢的平衡中发挥重要作用^[2]，其中肺部AQP1主要表达于肺组织的支气管黏膜、血管内皮、胸膜脏层和肺泡Ⅱ型上皮细胞，是肺组织的主要AQP，也是肺组织液体的快速转运通道。相关研究发现当小鼠肺毛细血管内皮缺乏AQP1时，肺泡毛细血管间水的渗透压力可以下降90%^[3]。AQP5主要表达于气管、支气管黏膜下层和肺泡Ⅰ型上皮细胞，是黏膜下腺体液体分泌的主要参与者，主要参与气道黏液的黏稠度调节。黏蛋白5AC（MUC5AC）是气道中极为显著的黏蛋白之一^[4]，是衡量气道上皮黏液分泌的指标之一^[5]。如在慢性阻塞性肺疾病中，黏液高分泌和黏蛋白过度表达是其特征之一^[6]，其中MUC5AC的分泌量占气道上皮黏蛋白分泌总量的95%。而黏蛋白的分泌以及与水液间平衡的失调，会导致呼吸道的细菌定植、黏液栓形成、通气功能障碍等，加重疾病进程^[7]。给予中度慢性阻塞性肺疾病患者8个月黏液溶解剂治疗，可以减少其急性加重与住院次数^[8]。中医药防治慢性阻塞性肺疾病的重要研究方向之一是对呼吸道黏液进行调节^[9]。止嗽散出自《医学心悟》，具有宣利肺气、疏风止咳作用，但目前缺乏其研究热点的前沿揭示，这些热点前沿是否与呼吸道黏液形成相关蛋白的表达有关尚不明确。本研究在揭示止嗽散热点前沿基础上，从AQP和黏蛋白（MUC）出发探究止嗽散发挥止咳作用的可能机制，为临床提供参考。

1 材料与方法 1.1 文献检索及处理 1.1.1 文献检索

以检索式“主题=止嗽散（精确）”检索中国知网（www.cnki.net）中收录的发表于1984—2023年的文章，检索日期：2023年10月27日。

1.1.2 文献筛选标准

1）纳入标准：止嗽散相关研究文献。2）排除标准：①重复发表文献（只纳入最早发表的1篇文献）；②题目、关键词、摘要、正文中涉及“止嗽散”，但仅提及而并非研究止嗽散的文章；③学位论文、会议论文、报纸、年鉴、图书、专利、标准、成果等非学术期刊文章。

1.1.3 文献规范化处理

1）期刊统一规范为现用刊名，如将《陕西中医学院学报》规范为《陕西中医药大学学报》。规范方法为在project文件夹中选择名称为“citespace.alias”的文件，打开后添加“陕西中医药大学学报#陕西中医学院学报”，单位、关键词的合并方式与此相同，确保每一条数据单独成行。2）如果单位标注为大学的学院、研究院、附属医院一律规范为大学名，如果具体到医院的科室则一律规范为医院后再规范为相应大学，如将天津中医学院及其附属医院统一为天津中医药大学、将山东中医学院附院内科规范为山东中医药大学、将广西中医药大学研究生院规范为广西中医药大学、将四川省中医药研究院附属医院规范为四川省中医药研究院。3）在进行高频关键词分析时，剔除检索词如“止嗽散”、所指过于宽泛的词如“中医药”等，但在进行聚类分析时这些词条予以保留。4）对具有相同含义但不同表述的关键词进行合并规范，如将“程国彭”统一归入“程钟龄”、将“穴位敷贴”统一归入“穴位贴敷”等。5）确定高频关键词：采用Donohue，根据齐普夫定律推导出的高频与低频词界分公式T=[-1+（1+8×I₁）^1/2]÷2，其中I₁代表词频为1的关键词个数，T代表高频词的最低频次数。

1.2 细胞实验 1.2.1 主要材料与仪器

1）主要材料：NCI-H292细胞，Trizol Cat #15596026（Invitrogen公司），RT逆转录试剂盒（TAKARA公司）SsoFast^TM EvaGreen^®超混合液（BIO-RAD公司），Anti-AQP5（ABCAM公司），Anti-AQP1（ABCAM公司），MUC5AC酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（武汉华美生物工程有限公司），FlexiRun TMpremix PAGE Solution、Quick Run^TM Fast Running Buffer、Read Blot^TM Fast Western Transfer Buffer（MD Bio青岛生工生物科技有限公司），PVDF膜（Millipore公司）。2）主要仪器：匀浆机（FastPrep-24，MP公司），凝胶成像系统（WO-9413B型，北京六一仪器厂），发光成像系统（Tanon 5200，上海天能科技有限公司），转移脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，TS-8型），酶标仪（Multiscan MK3，上海赛默生物科技发展有限公司），聚合酶链反应（PCR）仪（C1000，BIO-RAD公司），实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）仪（CFX96，BIO-RAD公司）。3）药物：《医学心悟》止嗽散，组成为荆芥9 g，陈皮6 g，炙甘草3 g，桔梗9 g，百部9 g，紫菀9 g，白前9 g，生姜3 g。中药饮片购自新疆中医医院中药房，7剂中药共计399 g，煎煮2次，低温烘干后制成浸膏134.6 g，打碎成粉末状，低温干燥保存待用。

1.2.2 实验方法

将NCI-H292细胞分为对照组、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）组和止嗽散组。细胞接种于6孔板中，采用含有10%胎牛血清的BI1640培养液进行NCI-H292细胞培养，培养箱条件设置为37 ℃、5%二氧化碳（CO₂）。待细胞融合达到80%~90%时传代并分组用于后续实验。1）qPCR方法检测AQP1 mRNA、AQP5 mRNA、MUC5AC mRNA含量：Trizol试剂提取总RNA，采用紫外分光光度计测量总RNA浓度，使用逆转录试剂盒将RNA进行逆转录，转录条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，12个循环。取稀释后的逆转录产物进行qPCR检测，qPCR反应条件为95 ℃30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 5 s，40个循环。引物序列为MUC5AC：上游5’-AACTGCAGCTGGACAGTGTG-3’，下游5’-TGCAGATCTGGGTCTCACAG-3’；AQP1：上游5’-GCTGGCTACTACCGACCG-3’，下游5’-AAAGGACCGAGCAGGGTT-3；AQP5：上游5’-GCTGGCATCCTCTACGGT-3’，下游5’-CAGCTGGAAGGTCAGAATCA-3’；GAPDH：上游5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，下游5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。采用2^-ΔΔCT对CT值进行换算处理。2）采用蛋白免疫印迹（Western blot）方法对AQP1、AQP5蛋白表达进行检测：细胞裂解后离心，二喹啉甲酸（BCA）法进行总蛋白定量测定，随后进行凝胶电泳、转模、封闭，一抗（1∶1 000）4 ℃过夜。添加Tween-20的Tris盐缓冲液（TBST）洗涤后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗（1∶2 000），室温反应1 h，再次洗膜后加入电化学发光（ECL）试剂，完全浸透后放于Tanon 5200中进行曝光。采用ELISA法检测MUC5AC蛋白，具体操作严格按照说明书进行。

1.3 统计学分析 1.3.1 文献研究

采用CiteSpace 6.2.R7和VOSviewer 1.6.18软件对收集的数据进行可视化计量学分析。参数设置：citespace 6.2.R7设定时间切片为1年，关联强度为cosine，每个时间切片选择阈值g-index（K=100）。为突出重点，本研究主要对文献的关键词进行分析，其中作者、机构、关键词共现分析采用VOSviewer 1.6.18软件进行，聚类分析、突现分析选取CiteSpace 6.2.R7软件进行。突现用于检测某一时间段内词频的突然增加情况，当一个术语的出现频次在短时间内急剧增加时，就会被定义为突现词，其突现强度与增加速度正相关，可能是下一阶段的热点研究方向。

1.3.2 细胞实验

采用IBM SPSS Statistics 27.0统计软件，计量资料结果以均数±标准差（x±s）表示，符合正态分布及方差齐性的数据，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，若方差不齐采用Tamhane’s T2法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 文献数量

检索得到文献1 283篇，查重后剩余文献1 267篇，发文量呈现波动上升趋势，1984—2003年的年平均发文量较低，2011—2019年维持在较高水平，2020—2023年发文量下降，见图 1。根据VOSviewer 1.6.18软件统计，共有2 097名作者参与了止嗽散相关研究，其中发文量超过3篇的作者有37人，排名前3位的作者依次是苗青（14篇）、徐乃玉（8篇）、顾振纶（8篇）。共有1 105个机构参与了止嗽散相关研究，其中发文量超过3篇的机构有42家，排名前3位的机构是广州中医药大学（27篇）、北京中医药大学（23篇）、中国中医科学院（20篇），见表 1。

2.2 关键词共现

关键词是一篇文章内容的高度概括，通过对关键词进行统计分析可以快速有效地阐明该领域的研究热点和趋势^[10]。本研究首先运用VOSviewer软件对关键词进行贡献分析，连线数（links）与总关联强度（total link strength）被用来代表关键词的联系及共现强度，强度大小取决于数值大小^[11]。通过分析共获得1 092个关键词，其中出现频数≥5次的关键词107个，计算得到T=38.745，因此出现频数≥39次的关键词为核心关键词，见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。除检索词“止嗽散”、意义过于宽泛的词如“中医药”“临床研究”“中西医结合”“治疗”外，核心关键词包括咳嗽、临床疗效、止咳散、久咳、外感咳嗽、咳嗽变异型哮喘、感染后咳嗽、三拗汤、喉源性咳嗽、感冒后咳嗽、慢性支气管炎、临床经验，见表 2。

2.3 关键词聚类

使用CiteSpace 6.2.R7对纳入文章的关键词进行聚类分析，得到13个聚类（Size＞6），见图 2及表 3，可以分为针对病种（咳嗽、慢性咳嗽、外感咳嗽、小儿咳嗽、哮喘）、合并使用方剂（止咳散、桑菊饮、小陷胸汤）、研究方法（名医经验、程钟龄）3个主要研究主题。关键词突现分析结果见表 4，显示延续时间最长的是外感咳嗽（1984—2001年，S=6.27），是止嗽散的主要治疗病种。持续至本研究的是肺功能（2015—2023年，S=4.42）、临床疗效（2017—2023年，S=8.21）、穴位贴敷（2017—2023年，S=3.91）、慢性咳嗽（2018—2023年，S=4.82）、加减治疗（2019—2023年，S=3.32）、二陈汤（2020—2023年，S=3.51），说明止嗽散对肺功能的影响、临床疗效是目前研究的热点前沿，研究病种也由“外感咳嗽”拓展至“慢性咳嗽”，并且伴随“加减治疗”“二陈汤”和“穴位贴敷”出现，体现出中医内外同治的思想正在逐步得到重视。

2.4 止嗽散对NCI-H292细胞AQP1 mRNA、AQP5 mRNA、MUC5AC mRNA表达的影响

采用qPCR方法对各组AQP1 mRNA、AQP5 mRNA、MUC5AC mRNA进行检测，发现与对照组比较，中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）组AQP1 mRNA、AQP5 mRNA下降（P＜0.01），MUC5AC mRNA升高（P＜0.01）；NE+止嗽散组AQP1 mRNA、AQP5 mRNA降低（P＜0.01）。与NE组比较，NE+止嗽散组MUC5AC mRNA降低（P＜0.01），见表 5。

2.5 止嗽散对NCI-H292细胞AQP1、AQP5蛋白表达的影响

使用Western blot法对各组AQP1、AQP5蛋白进行检测，结果发现与对照组比较，NE组及NE+止嗽散组AQP5下降（P＜0.05或P＜0.01），见图 3、表 6。

2.6 止嗽散对NCI-H292细胞MUC5AC蛋白表达的影响

使用ELISA法对MUC5AC蛋白进行检测，结果发现，与对照组比较，NE组和NE+止嗽散组MUC5AC蛋白表达均升高（P＜0.01）。与NE组比较，止嗽散治疗后MUC5AC有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表 7。

3 讨论

止嗽散出自程钟龄《医学心悟》，主治风邪犯肺证，是治疗外感咳嗽的基础方剂，临床可以对其加减治疗新久咳嗽、咳痰不爽。基于中国知网1984—2023年的文献计量学分析，发现止嗽散的研究热点如下：1）治疗病症为咳嗽、慢性咳嗽、外感咳嗽、小儿咳嗽、哮喘，其中外感咳嗽的热点持续时间最长。突现关键词提示近年来的研究热点趋势集中在对止嗽散进行加减以治疗慢性咳嗽方面，其中二陈汤可能是重要的联合使用方剂。Meta分析发现，止嗽散合二陈汤治疗慢性支气管炎急性发作不仅降低了临床复发率，还能减轻急性发作的症状程度，进而改善生活质量^[12]。2）辨证论治也是热点之一，体现中医诊疗疾病的特色优势。中医认为咳嗽与“痰”的关系密切，而“痰”与呼吸道黏液形成相关蛋白的状态密切相关。故而从黏蛋白角度探寻止嗽散治疗肺系疾病的可能作用机制是研究途径之一。基于网络药理学的研究发现磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）、低氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路等可能在止嗽散治疗慢性支气管炎过程中发挥关键作用，进一步的动物实验也对此进行了验证^[13]。而PI3K/Akt、HIF-1信号通路与AQP、MUC存在一定关系，如抑制PI3K/Akt表达后能够显著降低MUC5AC mRNA转录水平及MUC5AC表达^[14]，HIF-1活性降低可能抑制NP细胞AQP水平，损害了其对细胞外渗透压变化的反应能力^[15]。气道黏液由稀薄的浆液层和相对黏稠的黏液层构成^[16]，是毒素和病原微生物进入机体的有效屏障。气道黏液由水和黏蛋白组成，两者比例失调所导致的黏液黏稠可以诱使细菌黏附，并影响纤毛对细菌等的清除功能^[17]，故而对其调节意义重大。无论从中医理论或机制推导角度研究止嗽散，AQP和MUC都有可能是其作用靶点之一。

本研究发现经NE处理后，NCI-H292细胞AQP1 mRNA、AQP5 mRNA和AQP5下降，MUC5AC mRNA和MUC5AC升高；与NE组比较，经止嗽散治疗后，只有MUC5AC mRNA下降，其他指标变化不明显。说明MUC5AC可能是止嗽散的作用靶点之一，而且主要集中在转录水平发挥功能。虽然程钟龄谓“本方温润和平，不寒不热”，但国医大师何任认为本方药物偏于温燥，对于咳痰不爽的患者不甚适宜^[18]。本研究发现止嗽散对被NE诱导降低的AQP1 mRNA、AQP5 mRNA非但没有改善，反而进一步加重降低程度，对AQP5也有这种趋势，与何任教授观点一致。而AQP5的下降可能导致水转运障碍，进而使得黏稠度增高^[19]。有研究发现温燥可以降低AQP5 mRNA及其蛋白表达水平，而辛凉甘润的桑杏汤可以改善这种状态^[20]。止嗽散药性微温^[21]，提示在遇到津伤或痰黏稠难咳时应注意辨证论治，对其加减使用，不可囿于原方。有研究认为止嗽散加减可以上调寒燥型慢性阻塞性肺疾病小鼠已经降低的水通道蛋白4（AQP4）和AQP5蛋白表达水平^[22]。除止嗽散加减方外，一些具有止咳化痰作用的中药复方亦能对黏蛋白与AQP产生影响，如金水六君煎可以提高慢性阻塞性肺疾病模型大鼠AQP5表达，抑制MUC5AC表达。三仁汤可以通过促进肺组织AQP5表达，抑制MUC5AC分泌，从而阻止湿热环境下呼吸系统疾病气道的黏液高分泌状态。这些研究为本研究的进一步深入开展提供了良好借鉴，但本研究样本量较小，同时受制于实验条件等限制，导致所得到的证据级别不高，下一步拟通过收集止嗽散加减方干预前后的临床患者痰液等标本，进一步明确止嗽散对呼吸道黏液形成相关蛋白（MUC、AQP）的影响，并探讨相关机制。

综上，止嗽散的研究热点是咳嗽、慢性咳嗽、外感咳嗽、小儿咳嗽、哮喘等，咳嗽和哮病多因“痰”作祟，而“痰”与呼吸道黏液形成相关蛋白的状态密切相关，故而AQP与MUC有望成为止嗽散的研究切入点之一。细胞实验发现止嗽散可以下调NCI-H292细胞被NE诱导后高表达的MUC5AC mRNA，对高表达的MUC5AC蛋白存在下调趋势，止嗽散发挥理肺祛痰功效的作用机制可能主要和黏蛋白调控有关。但止嗽散不可通治所有类型咳嗽，临床应用时应当重视在辨证论治基础上合理加减。