木贼为木贼科植物木贼（Equisetum hyemale L.）的干燥地上部分，主要分布于中国黑龙江、辽宁、吉林、陕西、福建等地^[1-2]。《中国药典》2020年版一部中记载木贼味甘、苦，归肺、肝经，具有疏散风热，明目退翳等功效，临床常用于风热目赤，迎风流泪，目生云翳等症^[3]。木贼的化学成分复杂，主要含黄酮类、酚酸类、挥发油类等。现代药理研究表明：木贼具有降血脂、降血压、保肝、抗心肌缺血和抗肿瘤等作用^[4-6]。

近年来，关于木贼的研究主要集中于黄酮类成分，《中国药典》2020年版一部中仅将山柰酚作为木贼化学成分含量测定的唯一指标^[3]。然而，中药成分复杂，仅单一成分的含量测定，无法全面反映其质量优劣。指纹图谱运用现代分析技术，能够系统而全面地表征中药的共有及内在特征，具有较好的稳定性和重现性，是中药材质量评价的重要途径之一^[7-9]。化学模式识别技术能够深入挖掘指纹图谱信息，揭示中药内在成分差异，对其质量控制具有重要意义^[10-13]。因此，本研究将超高效液相色谱（UHPLC）指纹图谱、化学模式识别技术与指标成分定量相结合，以期为木贼质量评价提供参考，同时为木贼药效物质基础及其相关复方研究奠定基础。

1 仪器与材料 1.1 仪器

Agilent 1290超高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；十万分之一天平（波兰Radwag公司）；Milli-Q超纯水制备仪（Millipore公司）；G3KT18273型旋涡混合器（赛默飞世尔科技公司）；ZZ-L6DT超声波清洗机（天津知著科技有限公司）。

1.2 材料

对照品山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷（批号：DSTDS011501）、山柰酚-3-O-槐糖苷（批号：DSTDS001701）、阿魏酸（批号：DSTDL002101）、香草酸（批号：DSTDX008801）、绿原酸（批号：DSTDL002101）均购于成都德思特生物技术有限公司（纯度均大于98.0%）。甲酸、甲醇、乙腈购于Fisher公司，水为超纯水（由Milli-Q超纯水仪制备）。木贼信息来源见表 1。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY CSH C18柱；流动相：甲酸水（0.1%，A相）-乙腈（B相）；洗脱程序：（0~19 min，5%~10% B；19~35 min，10%~49% B）；检测波长：270 nm；进样量：2 μL；流速：0.3 mL/min。

2.2 供试品溶液的制备

精密称定木贼粉末1.00 g（过60目筛），精密量取20.00 mL的50%甲醇，超声处理45 min（300 W，40 kHz），冷却，补足失重，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称定对照品山柰酚-3-O-槐糖苷、阿魏酸、香草酸、绿原酸适量，50%甲醇溶解，配制成1 mg/mL的标准对照品溶液。精密称定山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷适量，50%甲醇溶解，配制成5 mg/mL的标准对照品溶液。

2.4 方法学考察 2.4.1 精密度

精密称定A10木贼粉末1.00 g，制备供试品溶液，连续进样6次。以绿原酸为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的相对标准偏差（RSD）≤0.36%，相对峰面积的RSD≤5.7%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性

精密称定A10木贼粉末1.00 g，制备供试品溶液，在0、2、4、8、12、24 h等时间点分别进样。以绿原酸为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD ≤ 0.12%，相对峰面积的RSD≤5.4%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性

精密称定A10木贼粉末6份，每份1.00 g，平行制备6份供试品溶液，进样测定。以绿原酸为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD≤0.75%，相对峰面积的RSD≤3.23%，表明方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立

将20批木贼粉末制成供试品溶液，连续进样。将数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件，以A1为参照图谱，采用平均数法生成对照图谱，时间窗宽度为0.1 min，进行多点校正，Mark峰匹配。生成20批木贼样品叠加图谱和对照图谱R，20批木贼中含14个共有峰，见图 1。经对照品比对后指认出3号峰香草酸、4号峰山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、6号峰绿原酸、9号峰阿魏酸、11号峰山柰酚-3-O-槐糖苷。对20批木贼样品进行相似度评价，其相似度均大于0.992，相似度较高，质量相对稳定，结果见表 2。

2.6 化学计量学分析 2.6.1 层次聚类分析（HCA）

层次聚类分析是一种可使复杂的多维数据标准化的分析方法，使用适当的度量和连接准则，通过构建树状图，直观地显示出被测样品间的相似性或差异性。以20批不同产地木贼药材的14个共有峰面积为原始数据，导入SIMCA 14.1软件，进行层次聚类分析。20批样品被分为两组，其中A1-A3为安徽产区，聚为一类；A4-A20为内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁产区，聚为一类。分类结果与药材产地相关性较大，结果见图 2。

2.6.2 正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）

正交偏最小二乘法判别分析作为一种有监督的判别分析工具，可以除去与分类无关的噪声变量，从而提高模型预测的准确性。其交叉验证和置换检验功能可评估模型的稳定性和可靠性，避免过拟合问题。以20批不同产地木贼的共有峰峰面积为原始数据，导入SIMCA 14.1软件进行分析。结果如图 3所示，20批木贼药材可分为两类，A1-A3聚为一类，A4-A20聚为一类。

为进一步筛选不同产地木贼药材间的标志性成分，选取了变量投影重要度（VIP）>1的成分作为差异性成分。其中，4号峰（山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷）>9号峰（阿魏酸）>3号峰（香草酸）>14号峰>13号峰>5号峰>1，共筛选出6个差异性成分，结果见图 4。

2.7 含量测定 2.7.1 线性关系考察

精密吸取对照品溶液适量，用50%甲醇稀释得香草酸浓度为200 μg/mL、山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷浓度为2000 μg/mL、绿原酸浓度为300 μg/mL、阿魏酸浓度为40 μg/mL、山柰酚-3-O-槐糖苷浓度为50 μg/mL的混合对照品溶液。用50%甲醇依次稀释2、2、2、2、2倍，得到系列对照品溶液，进样分析。并根据测得的峰面积（Y）和质量浓度（X）数据，绘制成含量测定的标准曲线，结果见表 3。

2.7.2 精密度

精密称定A10木贼粉末1.00 g，制备供试品溶液，连续进样6次。计算得香草酸、山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、绿原酸、阿魏酸、山柰酚-3-O-槐糖苷的RSD分别为0.82%、0.69%、0.48%、1.56%、1.28%，表明仪器精密度良好。

2.7.3 稳定性

精密称定A10木贼粉末1.00 g，制备供试品溶液，在0、2、4、8、12、24 h等时间点下，分别进样。计算得香草酸、山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、绿原酸、阿魏酸、山柰酚-3-O-槐糖苷的RSD分别为1.97%、1.74%、2.17%、2.43%、1.58%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.7.4 重复性

精密称定A10木贼粉末，平行制备6份供试品溶液，连续进样，按标准曲线法计算香草酸、山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、绿原酸、阿魏酸、山柰酚-3-O-槐糖苷的含量，RSD分别为2.84%、1.43%、1.63%、1.93%、2.99%，表明该方法重复性良好。

2.7.5 加样回收率

精密称定A10木贼粉末6份，每份0.50 g，加入一定量的混合对照品溶液，平行制备6份供试品溶液，进样测定。计算香草酸、山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、绿原酸、阿魏酸、山柰酚-3-O-槐糖苷的平均加样回收率依次是98.07%、95.26%、107.32%、106.53%、97.67%，RSD依次为7.69%、1.46%、5.05%、1.53%、3.2%，表明该方法准确度符合要求。

2.7.6 含量测定

精密称定20个批次的木贼粉末，制备成供试品溶液，平行进样3次。按照标准曲线法计算香草酸、山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、绿原酸、阿魏酸、山柰酚-3-O-槐糖苷5种成分的含量，取平均值，结果见表 4。

3 讨论 3.1 供试品制备方法的考察

本实验考察了不同提取溶剂（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇）、不同超声时间（30、45、60 min）以及不同料液比（1∶20、1∶50、1∶100）对色谱峰的影响。结果表明，以50%甲醇为提取溶剂，提取时间为45 min时，所得的色谱峰响应较强且数量最多。

3.2 色谱条件的优化

本研究采用210~400 nm全波长扫描，以更全面地展示木贼中所含的化学成分。结果表明在270 nm时各色谱峰数目、分离度均为最优，故选择270 nm为检测波长。同时还分析了不同色谱柱（ACQUITY CSH C18柱、BEH C18柱、HSS T3柱）以及不同体系流动相（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水等）的影响，最终确定了“2.1”项下的条件。

3.3 指纹图谱结果分析

20批木贼指纹图谱中含14个共有峰，经标准品比对，指认出3号峰香草酸、4号峰山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、6号峰绿原酸、9号峰阿魏酸、11号峰山柰酚-3-O-槐糖苷。相似度评价结果显示，20批药材相似度均大于0.992，表明这些样品在化学成分组成上一致性较好。层次聚类分析将20批木贼药材分为两类，正交偏最小二乘法判别分析的分类结果与层次聚类分析的结果一致，并筛选出6种差异性成分（经对照品比对指认出其中3种成分：山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、阿魏酸、香草酸）。不同产地的木贼化学成分存在显著差异，差异性成分则是A1-A3样品（安徽产区）与其它批次样品之间产生差异的主要原因。差异性成分的VIP值越大，对样品分类结果的贡献越大。

3.4 5种成分的含量测定

《中国药典》2020年版一部中仅以山柰酚作为木贼药材含量测定的指标成分，但是单一成分难以对药材进行全面的质量评价。本研究增加了对香草酸、山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、绿原酸、阿魏酸、山柰酚-3-O-槐糖苷的测定。其中，绿原酸具有抗炎、抗氧化、抗病毒等多种生物活性^[14]；香草酸具有较强的抑菌活性作用^[15]；阿魏酸可以抑制炎症^[16]；山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷具有保肝作用^[17]；山柰酚-3-O-槐糖苷具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和保肝作用^[18-20]；5种化合物均为木贼中的活性成分，对于木贼药效的发挥具有重要意义。因此，本研究在指纹图谱的基础上同步建立了香草酸、山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、绿原酸、阿魏酸、山柰酚-3-O-槐糖苷5种成分的含量测定方法。20批木贼药材5种成分平均含量分别为0.72、8.43、0.85、0.25、0.29 mg/g。

综上所述，该研究将UHPLC指纹图谱、化学计量学和5种成分含量测定相结合，不仅对不同来源木贼的质量进行了综合的评价，也可为后续含木贼制剂的开发提供参考。