天麻为兰科天麻属多年生寄生草本植物，以干燥块茎入药，又名鬼督邮、冬彭等，具有息风止痉，平抑肝阳，祛风通络的功效。天麻酚类化合物^[1]及其苷类为主要活性成分^[2]，2020版《中国药典》中天麻质量的衡定，也是以天麻素作为重要的参考指标^[3]。蜜环菌是口蘑科蜜环菌属的兼性寄生真菌，也是一种药食兼用真菌^[4]，又名糖蕈、栎菌等，蜜环菌菌丝可由深层发酵培养法培养^[5-6]。

天麻与蜜环菌除本身的药食用价值外，还具有复杂而有益的共生关系^[7]，蜜环菌是天麻的主要且必不可少的营养来源。天麻与蜜环菌既有相同的化学成分，如生物碱、有机酸、微量元素等，亦各含不同特征成分，如天麻素、原伊鲁烷倍半萜；天麻与蜜环菌药理作用相似^[8-10]。蜜环菌与天麻互相影响^[11]，蜜环菌亦可生物合成天麻素^[12]。以天麻与蜜环菌的共生关系为依据，以中药药剂学“药辅合一”的制剂理念和中药学“蜜环菌制剂代替天麻药用”的理论为骨架，将天麻作为主药，蜜环菌作为辅料，制备天麻有效成分的蜜环菌生物载药体，即天麻蜜环菌复合物，开展相关药学研究。以期制备出在天麻与蜜环菌镇痛、催眠、抗炎等药理作用中，更强药效的药物复合体，以及降低不良反应，提高患者耐受性。

1 材料和方法 1.1 材料与试剂

天麻药材（河北大中药业有限公司，批号：20190905，四川冬天麻）；蜜环菌（河北大中药业有限公司）；天麻素对照品（ChemFaces公司，批号：CFN99549，纯度：≥98%）；对羟基苯甲醇对照品（ChemFaces公司，批号：CFN97071，纯度：≥98%）；无水葡萄糖（北京索莱宝科技有限公司，批号：SG8510）；牛血清白蛋白（上海金穗生物科技有限公司，批号：20180418）；乙腈（色谱纯，Sigma-Aldrich公司）；甲醇（西格玛奥德里齐（上海）贸易有限公司）；磷酸（85%）（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂）；考马斯亮蓝G250（北京索莱宝科技有限公司，批号：20241010）；蒽酮（上海源叶生物科技有限公司，批号：M13IB209447）；二苯基苦基肼自由基（DPPH）（上海麦克林生化科技股份有限公司，批号：C14531845，纯度：≥98%）；抗坏血酸溶液、Tris-HCL缓冲液、磷酸二氢钾、硫酸镁、葡萄糖、盐酸、硫酸、乙醇、过氧化氢溶液、硫酸亚铁、水杨酸、邻苯三酚均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（上海天普分析仪器有限公司，LC2000）；低温离心机（Beckman coulter，MHD13G007）；立式压力蒸汽灭菌机（重庆雅马拓科技有限公司，SQ510C）；真空冷冻干燥机（北京松源华兴科技有限公司，LGJ-10F）。

1.3 方法 1.3.1 高效液相色谱（HPLC）法测定天麻素和对羟基苯甲醇的含量

色谱条件：色谱柱为Diamonsil C₁₈（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液（3∶97，V/V），等度洗脱；流速：1.0 mL/min；检测波长：220 nm；进样量：20 μL；分析时间：40 min；柱温30 ℃。在此色谱条件下，分别取对照品溶液、供试品溶液进样，并对该方法进行方法学考察。

对照品溶液的制备：取天麻素对照品、对羟基苯甲醇对照品适量，精密称定，加乙腈-水（3∶97）混合溶液制成含天麻素148.4 μg/mL、对羟基苯甲醇62 μg/mL的混合溶液，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密称定天麻蜜环菌复合物，置于试管中，加入适量乙腈-水（3∶97），破碎超声，清洗离心，得天麻蜜环菌复合物提取液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

精密度考察：取对照品溶液，连续测定进样6次，计算RSD分别为0.91%和1.63%，表明仪器精密度良好。

稳定性考察：取供试品溶液制备后分别在0、2、4、8、12、24、48 h后进样，测定供试品溶液中天麻素、对羟基苯甲醇的峰面积，RSD值分别为1.80%和1.53%，表明供试品稳定。

重复性考察：取同一批次天麻蜜环菌复合物，分别提取6份天麻蜜环菌复合物提取液，测定各供试品溶液中天麻素、对羟基苯甲醇的峰面积，RSD分别为1.59%和1.34%，表明该方法重复性良好。

加样回收率考察：取同一批次天麻蜜环菌复合物，分别提取6份天麻蜜环菌复合物提取液，分别精密加入相当于样品含量等量的天麻素、对羟基苯甲醇对照品，测定平均回收率分别为100.56%（RSD=1.72%）、102.13%（RSD=1.89%）。

1.3.2 蜜环菌培养及天麻母液的制备

制备培养基：以葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母浸膏0.2%，磷酸二氢钾0.15%，硫酸镁0.075%比例，加纯水适量制得液体培养基，将液体培养基倒入锥形瓶中，与培养皿一同置于高压蒸汽锅，121 ℃灭菌30 min。

所得菌种接种置含液体培养基的培养皿中室温避光培养5~7 d，即得蜜环菌菌丝。使用光学显微镜观察新鲜蜜环菌菌丝，显微镜下菌丝为无色透明的细菌体，有隔膜，每个细胞内有1~2个核，菌丝的先端稍弯曲。

天麻母液的制备：于150 mL锥形瓶中加入5.2 g天麻粗粉、35 mg α-淀粉酶、150 mL纯水，60 ℃水浴加热80 min，再置于超声波清洗机中超声30 min，100 ℃水浴灭活5 min后抽滤，滤液旋蒸浓缩得天麻提取液。将提取液醇沉，加入适量无水乙醇使其含醇量达55%，冷藏过夜，收集上清液，再加入适量乙醇使其含醇量达75%，冷藏过夜，收集上清液，旋蒸浓缩，得天麻母液，测定其天麻素及对羟基苯甲醇含量。

1.3.3 蜜环菌预处理制作壁材

利用食用菌在不同诱导因素下所进行的，由菌体外微生物及菌体内自溶酶共同作用导致的自溶过程^[13-14]。自溶后在细胞内各种自身酶的催化下细胞内的大分子物质分解成小分子物质，蛋白质降解成氨基酸，核酸降解成核苷酸，这些小分子物质从细胞壁中渗透出来，制备含菌丝体细胞空腔的蜜环菌壁材。将蜜环菌菌丝取出，纯水清洗离心（3 500 r/min，5 min，离心半径10 cm）至上清液未检测出蛋白质及可溶性糖，再抽滤至近干，收集菌丝。将洗净的菌丝如下进行预处理：物理处理—以-20 ℃冷冻30 min，于80 ℃水浴15 min，再超声15 min方法，反复5次；乙醇处理—加入5%的乙醇溶液，于54 ℃下，100 r/min自溶42 h；盐处理—加入5%的NaCl溶液，于54 ℃下，100 r/min自溶42 h。预处理菌丝纯水洗净离心（3 500 r/min、5 min），收集上清液，检测其蛋白质及可溶性糖含量；无水乙醇浸泡菌丝3次，每次5 min，菌丝于40 ℃烘箱24 h至恒质量，即得蜜环菌菌丝壁材。

1.3.4 蛋白质及可溶性糖含量检测

考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量^[3]：依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G250与蛋白质结合形成蓝色复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定预处理后菌丝溢出的蛋白质含量。

蒽酮硫酸法测定可溶性糖含量：利用多糖在浓硫酸作用下与蒽酮反应，生成有特殊颜色的化合物，一定范围内，颜色深浅与可溶性糖含量成正比。采用比色法测定预处理后菌丝溢出的多糖含量。

1.3.5 天麻蜜环菌复合物包埋制备

称取预处理后的菌丝壁材一定量于50 mL茄形瓶中，加入6 mL天麻母液，搅拌一定时间后离心（3 000 r/min，5 min），纯水洗涤3次，收集上清液；将复合物沉淀醇洗三次后常温风干，称质量，加适量纯水至试管中，使用超声破碎仪破碎1 min后离心（12 000 r/min，5 min），超声清洗机超声30 min，洗涤3次，收集上清液，得混合液^[15]。高效液相色谱法检测相应介质液及混合液中天麻素、对羟基苯甲醇的含量，计算载药量、包封率和包封产率。其中天麻素载药量（%）标为A1，天麻素包封率（%）标为A2，天麻素包封产率（%）标为A3；对羟基苯甲醇载药量（%）标为A4，对羟基苯甲醇包封率（%）标为A5，对羟基苯甲醇包封产率（%）标为A6。公式如下

(1)

(2)

(3)

1.3.6 层次分析法（AHP）确定权重

根据天麻有效成分含量及相应评价指标重要程度，“1.3.5”项下的A1、A2、A3、A4、A5、A6作为权重指标予以量化^[16]。根据表 1评分结果，AHP法计算该6项指标权重系数分别为0.423 7、0.199 2、0.199 2、0.093 5、0.042 2、0.042 2，一致性比例因子（CR）=0.0254 < 0.10，即指标优先比较判断矩阵具有满意的一致性，权重系数有效。综合评分（OD值）=A1×0.423 7+A2×0.199 2+ A3×0.199 2+A4×0.093 5+A5×0.042 2+A6×0.042 2。见表 1。

1.3.7 正交优化实验

正交实验：在芯材比、时间、温度三个单因素实验的基础上，选择芯材比（1∶3、1∶4、1∶5 mg/mg）、包埋时间（6、12、18 h）、包埋温度（50、60、70 ℃）为考察因素，采用正交表L₉（3⁴）进行正交试验，以“1.3.5”项下A1-A6为考察指标，筛选蜜环菌壁材包埋天麻有效成分的最优条件。见表 2。

1.3.8 抗氧化活性的测定

样品的制备：称取一定量蜜环菌壁材与天麻母液制备天麻蜜环菌复合物，利用超声破碎仪将蜜环菌壁材（于复合前等重量）、复合物充分破碎后，8 000 r/min离心5 min（离心半径10 cm），取上清液，加入纯水于超声清洗机超声30 min，收集上清液，重复3次，得原液，经预实验知，将原液稀释6倍后浓度适宜；测定复合物中天麻素浓度，并吸取一定量天麻素母液稀释至等浓度溶液，得母液样品；配制0.1 mg/mL抗坏血酸溶液（VC）做阳性对照，得VC样品。

DPPH自由基清除实验^[17]：精密称取2.00 mg DPPH于烧杯中，加入精密量取的25.36 mL无水乙醇，配制成0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液，避光保存。准确移取样品溶液500 μL于试管中，各加入1 mL DPPH溶液，混匀，避光放置30 min后，取200 μL置于96孔板中，共3孔，于517 nm波长下测定吸光度值A1。另取纯水替代DPPH溶液作为对照组，其余操作如上，测定吸光度值A2。另取纯水替代样品溶液作为空白组，其余操作如上，测定吸光度值A0。实验平行3次，取平均值。DPPH清除率计算公式（4）如下，清除率越大，则表示该试样的抗氧化活性越强。

(4)

羟基自由基清除实验^[18]：于试管中依次加入100 μL样品溶液、100 μL 6 mmol/L H2O2溶液、200 μL 6 mmol/L FeSO₄溶液和500 μL 6 mmol/L水杨酸乙醇溶液，摇匀，置于37 ℃水浴锅上反应30 min，于510 nm波长下测定吸光度值A₁。另以不加H₂O₂溶液作为对照组，其余按上述步骤操作，记录吸光度值A₂。另取纯水替代样品溶液作为空白组，其余操作如上，测定吸光度值A₀。实验平行3次，取平均值。·OH清除率计算公式（5）如下。

(5)

超氧阴离子自由基清除实验^[19]：于试管中依次加入200 μL样品溶液、0.05 mol/L、pH为8.2的Tris-HCL缓冲溶液900 μL，2.5 mmol/L邻苯三酚溶液80 μL，混匀后置于25 ℃水浴锅上反应4 min，加入8 mmol/L的盐酸200 μL，320 nm波长下测定其吸光度值A₁。对照组用纯水代替邻苯三酚溶液，其余按照上述步骤操作，记录吸光度值A₂。空白对照组中用纯水替代样品溶液，其余操作同上，检测其吸光度值A₀。实验平行3次，取平均值。O₂·^-清除率计算公式（6）如下。

(6)

1.3.9 天麻蜜环菌复合物的体外释放度测定

释放介质的配制：按照2020版药典方法进行配制模拟胃液（pH1.2、0.1 mol/L HCl）、模拟小肠液（pH6.8磷酸缓冲液）、模拟大肠液（pH7.8磷酸缓冲液）为释放介质，脱气处理。

天麻蜜环菌复合物中天麻素释放度的测定^[20]：采用直接释药法，分别称取干燥至恒重的天麻蜜环菌复合物数份，分别置于100 mL茄形瓶中，瓶中为50 mL不同pH释药介质溶液，将茄形瓶置于磁力搅拌器上，转速为100 r/min，水浴加热，温度保持（37±0.5）℃。在3、8、15、25、40、60、80、100 min，2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、14、23、25、28、32 h时间点下吸取1 mL释放介质，经0.45 μm微孔滤膜过滤测定天麻素含量，并补充等量等温新鲜介质，按如下公式计算累积释放率。每种介质平衡操作3次，结果以平均值表示。以释放率为纵坐标，释放时间为横坐标作图，考察天麻蜜环菌复合物在模拟胃肠液中的释放特性。

(7)

Ct：各取样时间点样品中天麻素浓度，单位为mg/mL；V0：释放介质总体积，表示取样体积，单位为mL；V：各时间点取样体积，单位为mL；W：加入的复合物中天麻素总量，单位为mg。

2 结果与分析 2.1 天麻素和对羟基苯甲醇的含量测定方法学考察

线性关系考察：将天麻素与对羟基苯甲醇对照品溶液按梯度稀释成系列质量浓度混合对照品溶液。按照“1.3.1”项下含量测定方法进样测定，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），分析天麻素与对羟基苯甲醇在各自线性范围内的线性关系。得天麻素标准曲线方程为Y=704.16X-2 515.8，R²=0.999；对羟基苯甲醇标准曲线方程为Y= 4 358.2X-8 156.9，R²=0.999 3，表明天麻素含量在21.2~148.4 μg/mL，对羟基苯甲醇含量在8.857~62.000 μg/mL时，该方法线性关系良好。见图 1。

2.2 蜜环菌培养与预处理结果

在培养基上接种1~2 d，由菌块向四周发出营养菌丝形成环状营养圈，2~3 d菌块表面出现稀疏的白色菌丝。3~4 d菌块布满白色菌丝，形成结构紧密的菌苔。5~6 d由菌苔长出白色气生菌丝，直立向上。7~8 d菌苔上出现老化菌丝，老化菌丝初呈锈黄色，后呈棕红色，在菌苔上显示斑状。当培养6~7 d时，选择具有大菌落，白色气生菌丝生长旺盛，未出现老化的菌丝及时应用。

清洗新鲜菌丝后的上清液未检测出蛋白质及可溶性糖，表明蜜环菌培养基已被洗净，后续预处理操作所得浅黄上清液均为菌丝细胞内容物。光学显微镜下，未处理菌丝内部存在大量液泡，经预处理后的菌丝细胞内部液泡明显减少，菌丝内部中空化，形成空腔结构，可能原因是菌丝细胞内的氨基酸酶、核酸酶被激活后，将细胞内的蛋白质、核酸类物质降解成小分子物质，通过细胞壁溶解在上层液中，所以上层溶液呈现黄色浑浊，蜜环菌细胞沉降在底部。且盐处理自溶效果优于未处理、物理处理、乙醇处理，内容物的流出为包封天麻母液提供空间条件，利于芯材的包埋复合。

检测发现5%NaCl处理所得上清液的蛋白质及可溶性糖浓度较高。将预处理所得壁材及未处理的菌丝按“1.3.5”项下操作，分别与天麻母液复合，由A1-A6 6个检测指标及综合评分可得，盐处理所得菌丝壁材为复合天麻母液能力最佳。见表 3。

2.3 正交实验结果

极差分析表可得3个因素的主次关系为C（温度/℃）>A（芯材比/mg：mg）>B（时间/h），最佳工艺为A2B2C3，A因素及C因素对评价指标有显著性的意义；由方差分析表可得，芯材比、复合时间及复合温度对复合工艺均影响较小；结合考虑综合评分和生产实际因素，最终确定最佳复合工艺为天麻母液：蜜环菌壁材为1∶4，复合时间为12 h，复合温度为70 ℃。

对最佳组合进行3次重复实验，测得平均值A1=0.229 9，A2=0.867 1，A3=0.943 3，A4=0.010 8，A5=0.442 7，A6=0.2981，RSD值分别为1.01%、0.94%、1.33%、1.86%、1.48%、1.22%，验证试验所得结果平行性好，说明正交实验优化的最优工艺条件稳定可靠。

2.4 抗氧化活性测定结果

由图 2可知，蜜环菌壁材、天麻蜜环菌复合物与天麻母液都具有较强的抗氧化活性，且两两对比皆有显著性差异，虽然各种方法的测定结果在数值上各不相同，但抗氧化能力呈现一致性：复合物>母液>蜜环菌≈VC，与0.1 mg/mL VC对比，复合物与天麻母液对自由基清除效果好，这结果表明天麻母液与蜜环菌壁材复合后，比其单一物抗氧化能力更强，初步验证及判定了3种物质之间的活性差异。

2.5 天麻蜜环菌复合物的体外释放度测定结果

3种pH不同的释放介质中，天麻蜜环菌复合物在25 min时天麻素累计释放率皆大于50%，即呈现先直线上升后缓慢缓释趋势。在pH1.2强酸释放介质中，蜜环菌细胞壁被破坏导致天麻素释放最快，且天麻素在强酸性介质中缓慢降解。即在天麻蜜环菌复合物中有效成分天麻素被包埋进蜜环菌菌丝细胞中，具体见图 3。

3 讨论

天麻作为传统名贵中药，对其有效成分及药理作用的研究多如繁星，本研究采用超声辅助酶提法提取得的天麻母液；与天麻共生的蜜环菌菌丝则采用液体培养，通过食用菌自溶机制制备壁材。将天麻母液与蜜环菌壁材复合并对复合工艺进行优化，得天麻蜜环菌复合物的最佳制备工艺为天麻母液∶蜜环菌壁材1∶4，复合时间12 h，复合温度70 ℃。并且蜜环菌壁材、天麻蜜环菌复合物与天麻母液对各自由基的清除能力强弱呈一致性，为复合物>母液>蜜环菌，为后续的体内抗氧化活性研究提供理论支撑。天麻蜜环菌复合物中天麻素的释放为缓释趋势，天麻有效成分大部分被菌丝细胞包合，为后续天麻蜜环菌缓释制剂制备提供基础研究。

天麻与食药用菌菌丝体培养物及代谢产物在代谢紊乱和中枢神经系统方面各种疾病的治疗有大量研究^[21]，这些基础研究为后续真菌与其共生中药合用提供一定的思路和方向。本研究以期以更加节能的工艺生产天麻蜜环菌复合物，减少资源浪费，并研究两者复合后的协同效应，提升其药用价值及营养功能。加强复合物制备技术研究开发，既促进中药材综合利用，又能扩大生产，提高产量，减少耗能。天麻与蜜环菌复合物的工艺研究处于发展阶段，未来将在工艺优化、功能研究和市场应用等多个方面实现突破。通过不断探索，期望能够为这类复合物的开发提供理论与实践基础，开发出高价值的保健品和药品，为健康产业作出积极贡献。

4 结论

采用液体培养收集新鲜茂盛的蜜环菌菌丝，并通过微生物自溶特点制备壁材，以考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，蒽酮硫酸法测定可溶性糖含量，筛选得最佳自溶条件为5%氯化钠溶液于54 ℃搅拌40 h。将天麻素、对羟基苯甲醇的载药量、包封率、包封产率作为天麻提取液与蜜环菌复合工艺优化的指标，并利用层次分析法确定相应权重，经单因素考察及正交优化，得最佳复合条件为天麻母液：蜜环菌壁材为1∶4，复合时间为12 h，复合温度为70 ℃。对天麻蜜环菌复合物、天麻母液、蜜环菌壁材进行DPPH、羟基自由基、超氧阴离子自由基清除实验，其体外抗氧化能力为天麻蜜环菌复合物>天麻母液>蜜环菌壁材。天麻蜜环菌复合物在pH1.2盐酸溶液、pH6.8 PBS及pH7.8 PBS三种释放介质中皆呈现先直线上升后缓慢缓释趋势，为天麻蜜环菌复合物持续用药提供些许思路。