清肺合剂为天津中医药大学第一附属医院已故著名中医儿科专家陈芝圃先生依据古方“麻杏石甘汤”，并结合毕生临床经验加减化裁开发而成的院内制剂。该方采用清热降气平咳喘之鱼腥草、青黛、黄芩为君药，配合清喉利咽，散风热壅结，畅呼吸通道之射干、桔梗及宽胸降肺气之枳壳，佐以开肺闭，平咳喘及降逆止咳、化痰平喘之品等12味药物组成，临床上用于治疗肺热咳喘、支气管炎和肺炎^[1]。

根据方剂配伍理论，黄芩与麻黄协同发挥清热降气平喘作用，枳壳主司宽胸降气，3味药构成清肺合剂的组方核心^[2-6]，建立涵盖核心药味的质量控制标准对确保制剂疗效至关重要。此外，中药复方作为复杂混合体系，其化学成分具有多样性和协同作用特征，传统质量控制方法难以全面反映药物的整体质量属性^[7]。采用多指标质量控制结合指纹图谱技术，可有效表征药物生产过程中的整体质量传递规律^[8-9]。清肺合剂现行质量评价体系仅涵盖薄层色谱（TLC）鉴别、pH值及相对密度等常规项目，尚缺乏针对有效成分的定量分析及整体表征的质量控制方法。研究拟构建清肺合剂的多维质量控制体系，建立鱼腥草、青黛及甘草的TLC鉴别方法，成品高效液相（HPLC）指纹图谱，并对黄芩苷、柚皮苷、新橙皮苷和盐酸麻黄碱4种有效成分进行定量分析，从而实现对本品质量的全面控制。

1 仪器、试剂与药物 1.1 仪器

HPLC仪，Waters e2695，PDA检测器，Empower工作站，美国，Waters公司；TLC成像仪，Biostep，DESAGA Technology；DK-98-ⅡA型电热恒温水浴锅，中国，天津泰斯特仪器有限公司；RV10型旋转蒸发仪，德国，IKA公司；KQ-400VDE型双频数控超声仪，中国，昆山市超声仪器有限公司；SECURA125-1CN型电子天平，德国，赛托利斯公司；MS303型电子天平，AL204-IC型电子天平，瑞士，梅特勒公司；中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版，中国，国家药典委员会。

1.2 试剂与药物

盐酸麻黄碱，111241-201809，含量测定用96.0%；柚皮苷，110722-202116，含量测定用93.5%；新橙皮苷，111857-202305，含量测定用99.6%；黄芩苷，110715-202223，含量测定用97.2%；靛蓝，110716-201602，含量测定用98.7%；靛玉红，110717-202106，含量测定用99.1%；甘草苷，111610-202209，含量测定用95.2%；白花前胡甲素，111711-201904，含量测定用99.4%；苦杏仁苷，110820-202109，含量测定用93.1%。以上对照品均购自中国食品药品检定研究院。清肺合剂所有组方药材均购自天津饮片厂，并经天津中医药大学李天祥教授鉴定。15个批次清肺合计（编号S1~S15）均由天津尚药堂制药有限公司生产并提供，具体信息见表 1。

甲醇，乙腈，均为色谱纯，德国，Merck；氢氧化钠，丙酮，均为分析纯，中国，国药集团化学试剂有限公司；冰醋酸，甲酸，甲苯，三氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇，乙醇，盐酸，均为分析纯，中国，天津市科密欧化学试剂有限公司；水为超纯水，Milli-Q超纯水机，美国。

2 方法与结果 2.1 TLC鉴别 2.1.1 鱼腥草TLC鉴别

取清肺合剂（编号：S1）20 mL，滴加3滴稀硫酸（50%硫酸），摇匀，用水饱和乙酸乙酯振摇提取2次，每次2 mL，合并乙酸乙酯层，用乙酸乙酯饱和水洗涤2次，每次20 mL，乙酸乙酯层蒸干，残渣用50%乙醇20 mL使完全溶解，转移到具塞锥形瓶中，加入稀硫酸8 mL，超声20 min，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯层，用乙酸乙酯饱和水洗涤2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯层，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

取鱼腥草阴性样品（取除鱼腥草外的其他药味）20 mL，同供试品溶液的制备方法制得鱼腥草阴性样品溶液。取鱼腥草药材5 g，加水80 mL，加热回流2 h，滤液用乙酸乙酯振摇提取2次，第1次50 mL，第2次30 mL，合并乙酸乙酯层，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为鱼腥草药材溶液。取槲皮素对照品0.5 mg，加甲醇1 mL使溶解，作为槲皮素对照品溶液。

分别吸取槲皮素对照品溶液3 μL、鱼腥草药材溶液8 μL、供试品溶液8 μL和鱼腥草阴性样品溶液8 μL，点样于同一高效硅胶G板，以甲苯-三氯甲烷-丙酮（8∶5∶7）为展开剂，展开、晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯（366 nm）下检视。供试品色谱中，在与槲皮素对照品和鱼腥草药材色谱相同位置上，有相同颜色斑点，且阴性无干扰。见图 1。

2.1.2 青黛的TLC鉴别

取清肺合剂（编号：S1）20 mL，用三氯甲烷振摇提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷层，蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作为供试品溶液。取青黛阴性样品（取除青黛外的其他药味）20 mL，同供试品溶液的制备方法制得青黛阴性样品溶液。取靛蓝和靛玉红对照品，分别加三氯甲烷制成每亳升含靛蓝1 mg、含靛玉红0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。

分别吸取靛蓝对照品溶液8 μL、靛玉红对照品溶液5 μL、供试品溶液8 μL和青黛阴性样品溶液8 μL点样于同一高效硅胶G板，以甲苯-三氯甲烷-丙酮（5∶8∶1）为展开剂，展开、晾干，置日光下检视。供试品色谱中，在与靛蓝、靛玉红对照品色谱相同位置上，有相同颜色斑点，阴性无干扰。见图 2。

2.1.3 甘草薄层鉴别

取清肺合剂（编号：S1）20 mL，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇5mL使溶解，加于中性氧化铝柱（100~200目，5 g）上，用40%甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇4 mL使溶解，作为供试品溶液。取甘草阴性样品（取除甘草外的其他药味）20 mL，同供试品溶液的制备方法制得甘草阴性样品溶液。另取甘草苷对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。

分别吸取甘草苷对照品3 μL、供试品溶液4 μL和甘草阴性样品溶液4 μL，点样于同一高效硅胶G板，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）为展开剂，展开、显色，晾干，105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光和紫外光灯（366 nm）下检视。供试品色谱中，在与甘草苷对照品和清肺合剂色谱相同位置上，有相同颜色斑点，阴性无干扰。见图 3。

2.2 色谱条件

色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）为流动相按表 2梯度洗脱；检测波长为280 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL；流速为每分钟1.0 mL。见表 2。

2.3 溶液的制备 2.3.1 对照品溶液的制备

取柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷及盐酸麻黄碱适量，精密称定，加甲醇制成每亳升含柚皮苷2 mg、新橙皮苷1 mg、黄芩苷2 mg、盐酸麻黄碱2 mg、苦杏仁苷2 mg、甘草苷2 mg及白花前胡甲素2 mg的混合标准溶液，备用。

2.3.2 样品溶液的制备

精密量取不同批次清肺合剂1 mL，置50 mL量瓶中，用70%甲醇稀释到刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 指纹图谱研究方法学验证 2.4.1 精密度实验

精密量取清肺合剂（编号：S1）1 mL，置50 mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“2.2”指纹图谱研究色谱条件进行测定分析，连续进样6次，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。各色谱峰相对峰面积的RSD值在0.02~0.19%，相对保留时间的RSD值在0.10~0.86%，表明该方法精密度较好。

2.4.2 重复性实验

精密量取清肺合剂（编号：S1）1 mL，共6份，分别置50 mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“2.2”指纹图谱研究色谱条件进行测定分析，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。各色谱峰相对峰面积的RSD值在0.02~0.19%，相对保留时间的RSD值在0.10~1.04%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性实验

精密量取清肺合剂（编号：S1）1mL，置50 mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别于0、4、8、16、24 h按“2.2”指纹图谱研究色谱条件进行测定分析，计算各时间点色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。各色谱峰相对峰面积的RSD值在0.65~5.29%，相对保留时间的RSD值在0.12~3.98%，表明样品在室温下放置24 h内基本稳定。

2.4.4 指纹图谱的建立及相似度分析

取15批次清肺合剂，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录共有峰的峰面积和保留时间。将15批次样品的HPLC数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 A版）》软件，中位数法建立指纹图谱，选择S1为参照图谱，进行多点校正和峰匹配，结果共标识共有峰18个，见图 4，并生成清肺合剂对照指纹图谱，见图 5。通过与对照品对比，对其中7个指纹峰进行指认，见图 6。2#色谱峰为盐酸麻黄碱（TR=10.82 min），4#为苦杏仁苷（TR=17.26 min），6#甘草苷（TR=27.43 min），9#柚皮苷（TR=33.58 min），11#新橙皮苷（TR=37.96 min），12#黄芩苷（TR=45.07 min），18#白花前胡甲素（TR=77.70 min）。采用相似度评价系统，对15批次清肺合剂色谱指纹图谱进行分析。结果显示，所有样品的相似度指标均在0.95以上，显示各批次清肺合剂在核心化学成分构成上具有一致性，进一步证明了该制剂的制备工艺稳定可靠。见表 3。

2.5 含量测定研究 2.5.1 线性关系考察

取“2.3.1”标准溶液适量，加甲醇分别制成每1 mL含柚皮苷10.16、20.32、67.73、169.33、338.66、677.31 μg，含新橙皮苷6.18、12.37、41.23、103.09、206.17、412.34μg，含黄芩苷7.77、15.55、51.83、129.57、259.13、518.27μg，含盐酸麻黄碱5.38、10.77、21.54、43.07、86.14、215.36 μg的对照品溶液，精密吸取各10 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.2”色谱条件分析，记录色谱图。以各对照品浓度（μg/mL）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线并进行回归计算得回归方程，结果见表 4。结果显示，柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷及盐酸麻黄碱在其浓度范围内与峰面积均呈现良好的线性关系（R>0.999）。

2.5.2 精密度实验

取“2.3.1”项下对照品溶液，连续进样测定，记录峰面积。柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷及盐酸麻黄碱峰面积的RSD值分别为1.8%、1.8%、1.8%、0.8%（n=12），结果表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性实验

取清肺合剂样品（编号：S1），共6份，按“2.3.2”项下方法平行制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件进样分析，计算样品中柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷及盐酸麻黄碱的含量。结果显示，上述4种成分含量的RSD值分别为1.5%、1.4%、1.5%、0.5%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.5.4 稳定性实验

取清肺合剂样品（编号：S1），按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件，分别于室温静置1、24、8、12、16、18、24、36、48 h时进样分析并记录峰面积。结果显示，48 h内的稳定性结果显示各成分色谱峰峰面积与0 h的RAD%值均＜2，说明供试品溶液在室温下放置48 h内基本稳定。

2.5.5 加样回收率实验

精密量取清肺合剂（编号：S1）0.5 mL，置50 mL量瓶中，精密加入加标对照品溶液25 mL（每毫升含柚皮苷74.1 μg，新橙皮苷40.6 μg，黄芩苷130.5 μg，盐酸麻黄碱43.02 μg，甲醇溶解），然后用70%甲醇定容到刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照“2.2”项下色谱条件进行测定，分别计算样品中柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷和盐酸麻黄碱的含量，计算回收率。加标回收率结果显示，柚皮苷平均回收率为95.0%，RSD值为1.2%，新橙皮苷平均回收率为93.1%，RSD值为2.0%，黄芩苷平均回收率为94.4%，RSD值为1.9%，盐酸麻黄碱平均回收率为89.8%，RSD值为1.2%；上述结果符合《中国药典》2020年版4部9101《分析方法验证指导原则》中的限度要求^[10]。

2.6 样品测定

取15批清肺合剂样品，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，以“2.2”项下色谱条件进样分析。柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷和盐酸麻黄碱的平均含量分别为：3.517、2.137、6.417、0.204 mg/mL，见表 5。

3 讨论

研究成功构建了清肺合剂的多维度质量控制体系。通过系统优化薄层色谱条件，建立了鱼腥草、青黛及甘草的TLC定性鉴别方法，该方法斑点清晰、阴性无干扰、具有良好的重现性和可靠性。处方中部分药味因成分复杂、阴性干扰显著等因素，暂未建立有效的鉴别方法，这一现象凸显了中药复方制剂质量控制的复杂性。提示针对中药复方，需建立多种技术联用的综合质量控制策略，以实现对其质量的全面评价。通过系统优化色谱条件，本研究成功建立了清肺合剂HPLC指纹图谱分析方法。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》对15批样品进行分析，结果显示样品相似度均在0.999以上，表明制剂生产工艺稳定，批间一致性良好。研究共标定18个共有峰，并成功鉴定了盐酸麻黄碱、苦杏仁苷等7个特征成分。该研究结果不仅为清肺合剂的质量控制提供了可靠的评价方法，同时通过特征成分的鉴定，为阐明该复方制剂的药效物质基础提供了科学依据。基于方剂配伍理论和化学成分分析，选取黄芩、麻黄和枳壳中的特征成分作为定量指标^[11-17]，建立了盐酸麻黄碱、柚皮苷、新橙皮苷和黄芩苷的含量测定方法。方法学验证结果显示，该方法具有良好的准确性和重现性。15批样品的含量测定结果稳定（RSD值＜3.0%），进一步证实了该制剂生产工艺的可靠性和质量可控性。

研究成功建立了TLC定性鉴别、HPLC指纹图谱及多成分定量分析相结合多维质量控制体系，实现了对清肺合剂整体质量特征的系统评价。该方法不仅为清肺合剂的质量控制提供了科学依据，同时为中药复方制剂的质量标准研究提供了新的方法参考，对推动中药现代化研究具有重要的理论和实践意义。