2025, Vol. 44文章信息
- 张方, 王馨悦, 翁志军, 陈子怡, 朱璐, 马喆, 杨玲, 吴焕淦, 刘慧荣
- ZHANG Fang, WANG Xinyue, WENG Zhijun, CHEN Ziyi, ZHU Lu, MA Zhe, YANG Ling, WU Huangan, LIU Huirong
- vlPAG脑区P2X3受体参与电针缓解IBS小鼠内脏高敏感的机制研究
- Mechanistic study on P2X3 receptors in the ventrolateral periaqueductal gray underlying electroacupuncture-induced relief of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome mice
- 天津中医药大学学报, 2025, 44(6): 519-526
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2025, 44(6): 519-526
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2025.06.07
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文章历史
收稿日期: 2025-01-20
2. 上海市针灸经络研究所, 上海 200030
2. Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian, Shanghai 200030, China
肠易激综合征（IBS）是以腹痛、腹胀或腹部不适为主要症状，与排便相关或伴随排便习惯如频率和（或）粪便性状改变，通过临床常规检查，尚无法发现能解释这些症状的功能性疾病[1]。由于饮食、环境和诊断的差异，各国之间的患病率差异很大。中国IBS的患病率也存在差异性，但相比其他亚洲国家，中国IBS患病率普遍较高[2]。IBS的病理生理机制尚未被完全阐明，目前认为是多种因素共同作用引起的肠-脑互动异常，主要包内脏高敏感、胃肠动力异常、肠黏膜屏障功能失调、肠道菌群紊乱，以及精神心理改变等[1]。现代研究认为内脏高敏感是IBS的核心病理机制，其导致的腹痛是目前研究的热点[3]。
P2X受体是一种配体门控性非选择性阳离子通道受体，有7个受体亚型，存在于大多数人体组织中。研究表明P2X受体被三磷酸腺苷激活后，增加对钠离子（Na+）、钾离子（K+）、钙离子（Ca2+）通透性，促进细胞膜电位的快速变化，从而参与广泛的生物学效应[4]。其中，P2X3受体广泛分布在与伤害性信息传递有关的感觉神经细胞上，在痛觉信息的外周和中枢神经传导和调制中发挥重要作用[5-6]。中脑导水管周围灰质（PAG）在疼痛的调节中起着重要作用，是机体内源性疼痛调制系统的一个重要组成部分，可分为4个区：背内侧区（dmPAG）、腹外侧区（vlPAG）、背外侧区（dlPAG）和外侧区（lPAG），其中参与疼痛调节的主要是vlPAG和lPAG[7-8]。有研究发现外侧区中脑导水管周围灰质神经元上的P2X3受体在脊髓上中枢对疼痛的调节中起抑制作用，电针可以通过上调外侧区中脑导水管周围灰质神经元上的P2X3受体表达缓解慢性压迫性损伤大鼠的神经痛症状[9]。本课题组在前期研究中发现外周神经系统的P2X3受体参与电针缓解IBS动物模型内脏高敏感的作用机制[10-12]，且发现电针可能通过调节vlPAG中γ-氨基丁酸（GABA）能神经元的活动缓解IBS小鼠的内脏高敏感[13]。为了进一步研究vlPAG脑区P2X3受体是否参与电针缓解IBS小鼠内脏高敏感的作用机制，实验研究采用膜片钳电生理技术记录vlPAG脑区神经元的电生理活动，探讨vlPAG脑区P2X3受体参与电针缓解IBS小鼠内脏高敏感的作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物无特定病原体（SPF）级C57雄性小鼠，体质量（20±2）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[动物许可证号：SCXK（沪）2022-0004]；SPF级Vgat-Cre雄性小鼠，体质量（20±2）g，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供[动物许可证号：SCKX（沪）2019-0002]，均饲养于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物中心，饲养环境：12 h昼夜节律交替、室温（20±2）℃，室内湿度50%~70%。适应性饲养1周后开始正式实验，所有动物实验均通过上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物中心伦理审查（伦理号：YYLAC-2021-143-2），实验过程中对实验动物的所有操作均符合动物福利的基本要求。Vgat-Cre雄性小鼠用于实验一部分，C57雄性小鼠用于实验一、二部分。
1.2 主要试剂和仪器戊巴比妥钠（Sigma，美国）；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，C9801，Sigma，美国）；矿物油（M5310，Sigma，美国）；α，β-meATP（M6517，Sigma，美国）；A-317491（M2979，Sigma，美国）；液体石蜡、氯化钠、氯化钾、无水乙醇、二甲苯、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、多聚甲醛、中性树胶粘合剂（国药集团化学试剂有限公司）；苏木精、伊红（南京建成生物工程研究所）；异氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司，中国）；pAAV-CaMKIIa-GCaMP6s-WPRE、rAAV2/9-EF1a-DIO-GCaMP6f（和元生物技术有限公司，中国）；一次性无菌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司，中国）；韩式经穴刺激仪（南京济生医疗科技有限公司，中国）；小动物麻醉机、桌面数显脑立体定位仪（深圳瑞沃德生命科技有限公司，中国）；光纤记录钙成像系统、陶瓷插芯、陶瓷套管（千奥星科南京生物科技有限公司，中国）；电极拉制仪P-1000（Sutter Instruments，美国）；体式显微镜（Olympus，日本）；光学显微镜（Olympus，日本）。
1.3 IBS动物模型制备按照完全随机设计原则，所有小鼠随机分为正常组和造模组。造模组小鼠参照文献[14]的方法制备IBS动物模型。具体方法为：小鼠造模前禁食24 h，不禁水。灌肠前使用2%戊巴比妥钠溶液按每100 g 0.25 mL腹腔注射麻醉小鼠，然后用婴儿棉签蘸取少量液体石蜡润滑肛周和扩张肠道，用1 mL注射器（去针头）连接小鼠灌胃针，抽取0.1 mL TNBS灌肠液（130 mg/m Lin 30% EtOH），根据小鼠生理曲度，缓慢插入小鼠肛门约3 cm，慢慢注入TNBS灌肠液。小鼠于灌肠后，倒置10 min（即头下尾上），防止灌肠液溢出，待小鼠清醒后给予正常饮食饮水，常规饲养21 d后进行模型鉴定。正常组小鼠采用上述方法灌肠0.1 mL生理盐水。
1.4 分组与干预在确定IBS内脏高敏感模型制备成功后，实验一部分将造模组小鼠随机分为模型组（MG）、电针组（EAG），同时设正常组（NG）；实验二部分将造模组小鼠随机分为MG、EAG、P2X3受体激动剂组（α，β-meATPG）、P2X3受体抑制剂组（A-317491G）。所有小鼠于模型制备3周后开始干预：1）NG：仅给予电针组相同固定。2）MG：仅给予电针组相同固定。3）EAG：针刺双侧足三里穴（ST36）[15]，针刺深度均3~4 mm，接韩氏经穴刺激仪，刺激参数：疏密波、频率2/100 Hz、电流1 mA，每日1次，每次30 min，连续7 d。4）α，β-meATPG：在vlPAG脑区通过埋置套管注射α，β-meATP[16] 10 μL，浓度10 μmol/μL，连续7 d。5）A-317491G：在vlPAG脑区通过埋置套管注射A-317491[17] 10 μL，浓度10 μmol/μL，连续7 d。电针、套管给药等干预均在每日上午9~11时之间进行。
1.5 检测方法 1.5.1 腹部撤退反射（AWR）实验全程要对小鼠进行两次（干预前和干预后）AWR评分，评分方法和标准参照文献[18]的实验操作。小鼠评分前禁食24 h，不禁水。直结肠扩张（CRD）刺激下记录AWR评分：在小鼠清醒状态下将自制球囊刺激仪从肛门顺直结肠生理曲度插入降结肠部位，利用三通阀将球囊刺激仪和医用血压计及注射器连成一体，分别给与15、30、45、60 mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa，下同）4个不同压力的CRD刺激。每只小鼠每个压力测量3次，每次CRD刺激持续约20 s，同一压力之间间隔1 min，不同压力之间间隔4 min，每次测量记录AWR评分，取3次测量均值作为最后评分值。
1.5.2 苏木精-伊红（HE）染色结肠石蜡切片（4 μm）60 ℃烘干箱中烘片60 min；二甲苯Ⅰ15 min；二甲苯Ⅱ15 min；梯度酒精100%→90%→80%→70%，各3 min；流水冲洗10 min；HE染色2 min；流水冲10 min；1%盐酸酒精分化1 s；流水冲洗10 min；HE染色2 min；梯度酒精70%→80%→90%→100%，各1 min；二甲苯Ⅰ15 min；二甲苯Ⅱ15 min；中性树胶封片；光学显微镜下观察，采集图片。
1.5.3 在体钙信号光纤记录先在异氟烷诱导盒中将小鼠麻醉，然后将小鼠固定在脑立体定位仪上，同时连接麻醉机，将氧气调节至0.8%~1.0%，异氟烷浓度维持在1.2%~1.5%。以Bregma点为坐标原点，以X轴±0.6 mm，Y轴-4.8 mm，Z轴-2.8 mm为注射点，以每10 nL/min的速率缓慢注射300 nL病毒（c57小鼠注射pAAV-CaMKIIa-GCaMP6s-WPRE病毒，Vgat-Cre小鼠注射rAAV2/9-EF1a-DIO-GCaMP6f病毒），注射结束后留针10 min。随后在注射点正上方0.3 mm处埋置陶瓷插芯，并用牙科水泥固定。待病毒表达3周后进行光纤记录实验，给予488 nm激发光，然后对清醒状态下的小鼠进行20 s的45 mmHg CRD刺激，记录荧光信号。
1.5.4 膜片钳记录膜片钳记录前先制备脑片，孵育后置于浴槽内，用持续通氧的人工脑脊液（93 mmol/L N-甲基-D-葡糖胺、2.5 mmol/L氯化钾、1.25 mmol/L磷酸二氢钠、10 mmol/L硫酸镁、30 mmol/L碳酸氢钠、25 mmol/L葡萄糖、20 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、5 mmol/L抗坏血酸钠、3 mmol/L丙酮酸钠、2 mmol/L硫脲，浓盐酸调pH为7.4左右；模型+α，β-meATPG的灌流液额外增加α，β-meATP，终浓度为100 μmol/mL；模型+A-317491G的灌流液额外增加A-317491，终浓度为10 μmol/mL）灌流。玻璃微电极用P-1000电极拉制仪拉制而成，灌入电极内液（133 mmol/L葡萄糖酸钾、18 mmol/L氯化钠、0.6 mmol/L乙二醇双四乙酸、10 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、2 mmol/L腺苷5’-三磷酸镁盐、0.3 mmol/L鸟苷-5’-三磷酸三钠盐，1 mol/L氢氧化钾调pH为7.4左右）后阻抗为5~7 MΩ。记录时滤波频率为1 kHz，采集频率为10 kHz，钳制电压为-70 mV。在电流钳模式下，给予强度为-100~200 pA的电流刺激，间隔20 pA，记录静息膜电位（RMP）值、动作电位（AP）频率和基强度值。
1.6 统计学方法采用SPSS 24.0统计软件进行数据统计分析。实验研究数据均为计量资料，数据不服从正态分布，用M（Q25，Q75）表示，采用非参数检验分析组间差异；数据服从正态分布，用均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析进行组间比较。检验水准为α=0.05，P＜0.05具有统计学意义。
2 结果 2.1 电针可以改善IBS小鼠的内脏高敏感状态模型制备21 d后随机抽取NG和造模组小鼠进行结肠HE染色，观察结肠组织病理学变化。结果示：NG和造模组小鼠结肠组织结构完整，腺体形态正常分布均匀，无明显充血、溃疡、炎性细胞浸润等病理改变。两组小鼠结肠组织无明显形态学差异，均符合IBS临床无明显器质性改变的结肠病理表现。见图 1。
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| 图 1 结肠组织HE染色 |
模型制备21 d后对NG和造模组小鼠进行干预前AWR评分检测，观察小鼠内脏高敏感状态。结果示：与NG比较，造模组小鼠在4个压力等级CRD刺激下的AWR评分均明显升高（均P < 0.05），结合结肠组织HE染色无明显器质性改变提示IBS内脏高敏感小鼠模型制备成功。见表 1。
| mmHg | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | 动物数 | 压力等级 | |||||||||||||||||||||||||||
| 15 | 30 | 45 | 60 | ||||||||||||||||||||||||||
| NG | 6 | 0.33(0.00, 0.33) | 1.33(1.33, 1.42) | 2.67(2.67, 2.75) | 3.33(3.00, 3.75) | ||||||||||||||||||||||||
| 造模组 | 12 | 0.67(0.42, 0.92)** | 2.17(1.75, 2.67)** | 3.17(3.00, 3.33)** | 4.00(3.67, 4.00)* | ||||||||||||||||||||||||
| 注：同一压力等级下，与NG比较，*P＜0.05，**P＜0.01。 | |||||||||||||||||||||||||||||
电针干预结束后对各组小鼠进行干预后AWR评分检测，观察电针对小鼠内脏高敏感的影响。结果示：与NG比较，MG小鼠在4个压力等级CRD刺激下的AWR评分均增加（均P＜0.01），提示IBS小鼠的内脏高敏感持续存在；与MG比较，EAG小鼠在15、30、45 mmHg压力CRD刺激下的AWR评分均下降（均P＜0.01），在60 mmHg压力CRD刺激下的AWR评分差异无统计学意义，但也呈下降趋势，提示电针能降低IBS小鼠的内脏高敏感状态。见表 2。
| mmHg | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | 动物数 | 压力等级 | |||||||||||||||||||||||||||
| 15 | 30 | 45 | 60 | ||||||||||||||||||||||||||
| NG | 6 | 0.00(0.00, 0.33) | 1.00(0.92, 1.33) | 2.00(1.92, 2.08) | 3.00(3.00, 3.42) | ||||||||||||||||||||||||
| MG | 6 | 0.67(0.59, 1.00)** | 2.17(2.00, 2.33)** | 3.00(3.00, 3.33)** | 3.84(3.59, 4.00)** | ||||||||||||||||||||||||
| EAG | 6 | 0.33(0.00, 0.33)## | 1.33(1.25, 1.67)*## | 2.17(2.00, 2.42)## | 3.50(3.33, 3.67)* | ||||||||||||||||||||||||
| 注：同一压力等级下，与NG比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与MG比较，##P＜0.01。 | |||||||||||||||||||||||||||||
电针干预可以调节vlPAG脑区神经元的活动。为研究这一作用，实验通过在体钙信号光纤记录技术观察45 mmHg压力的CRD刺激下，vlPAG脑区内谷氨酸（Glu）能和GABA能神经元的活动变化。结果显示：给予CRD刺激时，与NG相比，MG小鼠vlPAG脑区Glu能神经元的钙离子内流显著增加，而经过电针干预后，Glu能神经元的钙离子内流增加幅度明显减小，见图 2A。此外，CRD刺激导致MG小鼠vlPAG脑区GABA能神经元的钙离子内流减少，而电针干预后，GABA能神经元的钙离子内流增加幅度显著提高，见图 2B，提示电针可以有效调节vlPAG脑区神经元的活动状态。
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| 注：图A，vlPAG脑区Glu能神经元对45 mmHg压力CRD刺激的反应；图B，vlPAG脑区GABA能神经元对45 mmHg压力CRD刺激的反应。 图 2 电针干预对vlPAG脑区Glu能和GABA能神经元钙信号的调节作用 |
模型制备21 d后对MG、EAG、α，β-meATPG、A-317491G小鼠进行干预前AWR评分检测，观察小鼠内脏高敏感基线状态。结果示：4个组间AWR评分差异无统计学意义（均P＞0.05），4个组间数据均衡可比。见表 3。
| mmHg | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | 动物数 | 压力等级 | |||||||||||||||||||||||||||
| 15 | 30 | 45 | 60 | ||||||||||||||||||||||||||
| MG | 6 | 0.50(0.33, 1.08) | 1.84(1.33, 2.67) | 3.00(2.67, 3.08) | 3.67(3.67, 4.00) | ||||||||||||||||||||||||
| EAG | 6 | 0.67(0.33, 0.84) | 2.00(1.67, 2.33) | 3.00(2.59, 3.08) | 3.84(3.33, 4.00) | ||||||||||||||||||||||||
| α, β-meATPG | 6 | 0.67(0.25, 1.00) | 1.67(1.59, 2.42) | 2.67(2.67, 3.08) | 3.67(3.59, 4.00) | ||||||||||||||||||||||||
| A-317491G | 6 | 0.67(0.50, 0.75) | 2.17(1.59, 2.42) | 3.00(2.67, 3.08) | 3.67(3.59, 4.00) | ||||||||||||||||||||||||
干预后对各组小鼠进行AWR评分检测，观察干预措施对小鼠内脏高敏感的影响。结果示：与MG比较，EAG小鼠在30、45、60 mmHg压力CRD刺激下的AWR评分均降低（均P＜0.05），α，β-meATPG在4个压力CRD刺激下的AWR评分均降低（均P＜0.05）；与EAG比较，α，β-meATPG小鼠在4个压力CRD刺激下的AWR评分差异无统计学意义，A-317491G小鼠在15、45、60 mmHg压力CRD刺激下的AWR评分均升高（均P＜0.05）；与α，β-meATPG比较，A-317491G小鼠在4个压力CRD刺激下的AWR评分均升高（均P＜0.05）。结果表明电针对IBS小鼠内脏高敏感的调节作用与P2X3激动剂一致，提示vlPAG脑区P2X3受可能介导电针改善IBS小鼠的内脏高敏感状态。见表 4。
| 组别 | 动物数 | 压力等级 | |||
| 15 | 30 | 45 | 60 | ||
| MG | 6 | 0.67(0.33, 1.08) | 2.17(1.92, 2.67) | 3.00(2.67, 3.08) | 3.67(3.59, 4.00) |
| EAG | 6 | 0.33(0.00, 0.67) | 1.67(1.67, 1.75)** | 2.50(2.33, 2.67)** | 3.33(3.33, 3.67)* |
| α, β-meATPG | 6 | 0.33(0.00, 0.42)* | 1.50(1.33, 1.67)** | 2.50(2.25, 2.67)** | 3.33(3.00, 3.67)* |
| A-317491G | 6 | 0.67(0.59, 1.00)#△ | 2.00(1.67, 2.42)△△ | 3.00(2.67, 3.08)##△△ | 3.84(3.67, 4.00)##△△ |
| 注：同一压力等级下，与MG比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与EAG比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与α，β-meATPG比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。 | |||||
干预后通过全细胞膜片钳技术记录vlPAG脑区神经元的RMP、动作电位频率和基强度，观察干预措施对小鼠vlPAG脑区神经元膜电学特性的影响。结果示：与MG比较，EAG和α，β-meATPG小鼠vlPAG脑区神经元的动作电位个数均明显升高（均P＜0.05），α，β-meATPG小鼠vlPAG脑区神经元的基强度明显降低（P＜0.05），A-317491G小鼠vlPAG脑区神经元的RMP和动作电位个数均明显降低（均P＜0.05），而基强度明显升高（P＜0.01）；与EAG比较，A-317491G小鼠vlPAG脑区神经元的RMP和动作电位个数均明显降低（均P＜0.05），而基强度明显升高（P＜0.01）。结果表明电针与α，β-meATPG作用一致，能够调节IBS小鼠vlPAG脑区神经元的动作电位发放。见图 3和表 5。
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| 图 3 200 pA去极化电流注入vlPAG脑区神经元时产生动作电位的代表性痕迹 |
| 组别 | 细胞数 | RMP(mV) | AP个数 | 基强度(pA) |
| MG | 6 | -57.44±1.54 | 31.67±15.09 | 103.33±15.06 |
| EAG | 6 | -56.64±1.70 | 42.67±17.94* | 86.87±20.66 |
| α, β-meATPG | 6 | -55.60±2.13 | 52.67±11.55** | 76.67±23.38* |
| A-317491G | 6 | -60.15±1.26*##△△ | 19.00±18.85*##△△ | 140.00±21.91**##△△ |
| 注：同一压力等级下，与MG比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与EAG比较，##P＜0.01；与α，β-meATPG比较，△△P＜0.01。 | ||||
内脏高敏感是指因机体内脏疼痛阈值降低而对生理性或伤害性刺激产生强烈反应的现象[19-20]，被认为是IBS的主要生理病理基础，也被证实在包括IBS在内的胃肠道内脏痛中发挥着重要作用[21-22]。胃肠道内脏痛的发病机制复杂，主要包括外周敏化和中枢敏化：外周敏化是指外周神经中感受器及传入神经敏感性增加，中枢敏化是指脊髓及大脑对肠道系统疼痛信号的调节及放大[23]。针灸疗法是中医学的特色疗法，主要通过激发机体内源性镇痛系统发挥镇痛作用，涉及外周、中枢各级神经系统和参与疼痛过程的各种离子、受体、通道、神经递质、神经调质和神经肽间的复杂网络等[24-25]，对包括IBS内脏痛在内的各类疼痛均有显著的镇痛作用。
TNBS灌肠法是制备IBS动物模型的常用方法[26]。本实验研究采用该方法制备的IBS小鼠结肠组织无明显的形态学改变，主要表现为内脏敏感度升高，符合IBS的病理学特征[3]。本实验研究采用电针ST36干预IBS内脏高敏感小鼠。电针疗法是电针仪输出脉冲电流，通过毫针作用于人体经络穴位来治疗疾病的一种治疗方法，电针疗法在镇痛方面得到了国际的认可[27]。足三里穴是足阳明胃经的合穴，六腑胃的下合穴，具有健脾和胃、调治肠腑的作用，对呃逆、呕吐、腹胀、腹痛等胃肠疾病疗效极佳[28]。中医古籍中也有“肚腹三里留”（《针灸聚英·四总穴歌》）“腹痛轻者只针三里”（《医学入门》）“腹中不便，取三里”（《针灸甲乙经》）等应用足三里穴治疗腹痛的记载[29]。现代研究表明针灸足三里穴可通过影响内脏敏感性、胃肠动力、肠道菌群及精神心理因素等调控脑-肠轴从而治疗IBS[30]。本实验研究通过AWR评分检测电针干预对IBS小鼠内脏高敏感的影响，发现电针干预后IBS小鼠内脏高敏感降低，证实电针通过调节内脏高敏感治疗IBS，与前期研究结果一致[13]。
PAG是机体内源性疼痛调制系统的关键部位，它接收来自脊髓后角、下丘脑以及前脑的大量传入纤维，同时也发出传出纤维至延髓，同时参与痛觉的上行/下行调控[7, 31]。PAG对疼痛的双重调节作用主要与PAG内Glu能和GABA能神经元活动有关[32-33]。前期研究也发现vlPAG中GABA能神经元活动与内脏痛相关，并且参与电针缓解IBS内脏高敏感的作用机制[13]。实验通过在体钙信号光纤记录研究发现IBS小鼠vlPAG脑区Glu能神经元钙离子内流增加，GABA能神经元钙离子内流减少，而电针干预能下调vlPAG脑区Glu能神经元钙离子内流，上调GABA能神经元钙离子内流，进一步证实vlPAG脑区神经元活动参与了电针缓解IBS内脏高敏感的作用机制。
P2X3受体参与痛觉信息的传导和调制已逐渐被认可，且研究发现P2X3受体在神经系统不同的位置对于疼痛的调控作用也不同。当机体受到伤害性刺激，背根神经节以及脊髓背角的P2X3受体大量被激活，并通过易化谷氨酸在脊髓背角的释放，参与疼痛的形成和维持[34]；而在脊髓以上中枢，P2X3受体则被证明具有镇痛效果。研究发现[35]在PAG注射α，β-meATP可以显著的提高神经病理性疼痛大鼠的痛阈值，而这种镇痛作用又可以被A-317491（P2X3特异性阻断剂）减弱。那么vlPAG脑区神经元中P2X3受体是否参与电针缓解IBS内脏高敏感的过程呢？为了解答这个问题，我们通过在IBS内脏高敏感小鼠vlPAG脑区注射α，β-meATP或A-317491，激活或抑制小鼠vlPAG脑区神经元上的P2X3受体，观察IBS内脏高敏感小鼠的行为学变化和vlPAG脑区神经元细胞的膜电学特性变化。结果发现电针和P2X3受体激动剂都能降低IBS小鼠各压力等级CRD刺激下的AWR评分，增加vlPAG脑区神经元发放动作电位的个数，而P2X3受体抑制剂则发挥反方向的作用，说明vlPAG脑区神经元上的P2X3受体参与IBS内脏高敏感的发生发展过程，而电针与P2X3受体激动剂作用一致，均可激活vlPAG脑区神经元上的P2X3受体，促进vlPAG脑区神经元的活化，改善IBS小鼠的内脏高敏感。
本实验研究主要通过在体钙信号光纤记录证实vlPAG脑区神经元活动参与电针缓解IBS内脏高敏感的作用机制，通过行为学检测和膜片钳技术发现电针可能是通过激活vlPAG脑区神经元上的P2X3受体促进vlPAG脑区神经元的活化，抑制内源性镇痛系统，进而改善了IBS小鼠的内脏高敏感，初步揭示了电针缓解IBS内脏高敏感的部分中枢神经机制。不足之处是本实验研究只对vlPAG脑区神经元上的P2X3受体进行研究，没有对vlPAG脑区特定类型神经元上的P2X3受体进行研究，也没有检测神经元中P2X3受体的蛋白和基因表达，后续仍需通过Cre转基因小鼠、单细胞蛋白和基因检测技术进一步验证本实验研究的结果，以及深入研究电针缓解IBS内脏高敏感的中枢神经机制。
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中华医学会消化病学分会胃肠功能性疾病协作组, 中华医学会消化病学分会胃肠动力学组, 侯晓华, 等. 2020年中国肠易激综合征专家共识意见[J]. 中华消化杂志, 2020, 40(12): 803-818. DOI:10.3760/cma.j.cn311367-20201116-00660 |
| [2] |
赵尔樱, 周佳玮, 褚海云, 等. 肠易激综合征流行病学与致病因素研究进展[J]. 中国公共卫生, 2021, 37(4): 764-768. |
| [3] |
TIAN S Y, ZHANG H, CHEN S Q, et al. Global research progress of visceral hypersensitivity and irritable bowel syndrome: Bibliometrics and visualized analysis[J]. Frontiers in Pharmacology, 2023, 14: 1175057. DOI:10.3389/fphar.2023.1175057 |
| [4] |
BURNSTOCK G, KENNEDY C. Chapter 11 P2X receptors in health and disease[J]. Advances in Pharmacology, 2011, 61: 333-372. |
| [5] |
GINIATULLIN R, NISTRI A. Desensitization properties of P2X3 receptors shaping pain signaling[J]. Frontiers in Cellular Neuroscience, 2013, 7: 245. |
| [6] |
吴海姣, 王冬梅. P2X3受体在病理性疼痛中的研究进展[J]. 福建师范大学学报(自然科学版), 2023, 39(2): 113-121, 136. |
| [7] |
何景新. 中脑导水管周围灰质的神经环路研究进展[J]. 世界最新医学信息文摘, 2024, 24(28): 62-66. |
| [8] |
代长奇, 余良主, 熊丽. 中脑导水管周围灰质参与痛觉调控的研究进展[J]. 医学理论与实践, 2024, 37(5): 745-747. |
| [9] |
肖智. 中脑导水管周围灰质P2X3受体在电针镇痛中的作用[D]. 重庆: 第三军医大学, 2010.
|
| [10] |
ZHANG F, MA Z, WENG Z J, et al. P2X3 receptor in primary afferent neurons mediates the relief of visceral hypersensitivity by electroacupuncture in an irritable bowel syndrome rat model[J]. Gastroenterology Research and Practice, 2020, 2020(1): 8186106. |
| [11] |
张方, 周云, 吴焕淦, 等. DRG中P2X3受体参与艾灸足三里穴缓解肠易激综合征大鼠内脏痛的研究[J]. 上海针灸杂志, 2020, 39(6): 775-782. |
| [12] |
周云, 张方, 闫翠娜, 等. P2X3受体介导电针调节肠易激综合征内脏痛大鼠结肠5-HT、SERT的作用研究[J]. 环球中医药, 2023, 16(9): 1715-1722. DOI:10.3969/j.issn.1674-1749.2023.09.001 |
| [13] |
王馨悦, 翁志军, 刘慧荣, 等. vlPAG中GABA能神经元参与电针缓解IBS小鼠内脏痛的机制研究[J]. 天津中医药大学学报, 2023, 42(5): 594-599. |
| [14] |
HUGHES P A, BRIERLEY S M, MARTIN C M, et al. Post-inflammatory colonic afferent sensitisation: Different subtypes, different pathways and different time courses[J]. Gut, 2009, 58(10): 1333-1341. DOI:10.1136/gut.2008.170811 |
| [15] |
WENG Z J, WU L Y, ZHOU C L, et al. Effect of electroacupuncture on P2X3 receptor regulation in the peripheral and central nervous systems of rats with visceral pain caused by irritable bowel syndrome[J]. Purinergic Signalling, 2015, 11(3): 321-329. DOI:10.1007/s11302-015-9447-6 |
| [16] |
FABBRETTI E, NISTRI A. Regulation of P2X3 receptor structure and function[J]. CNS & Neurological Disorders Drug Targets, 2012, 11(6): 687-698. |
| [17] |
WANG S S, ZHU H Y, JIN Y, et al. Adrenergic signaling mediates mechanical hyperalgesia through activation of P2X3 receptors in primary sensory neurons of rats with chronic pancreatitis[J]. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology, 2015, 308(8): G710-G719. DOI:10.1152/ajpgi.00395.2014 |
| [18] |
AL-CHAER E D, KAWASAKI M, PASRICHA P J. A new model of chronic visceral hypersensitivity in adult rats induced by colon irritation during postnatal development[J]. Gastroenterology, 2000, 119(5): 1276-1285. DOI:10.1053/gast.2000.19576 |
| [19] |
武建明, 雷源, 古巧燕. Nesfatin-1致肠易激综合征内脏高敏感发生机制的研究[J]. 医学综述, 2022, 28(7): 1389-1393. DOI:10.3969/j.issn.1006-2084.2022.07.025 |
| [20] |
GRUNDY D. What activates visceral afferents?[J]. Gut, 2004, 53(Suppl 2): ii5-ii8. |
| [21] |
BLACK C J, FORD A C. Global burden of irritable bowel syndrome: Trends, predictions and risk factors[J]. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2020, 17(8): 473-486. |
| [22] |
DEITEREN A, DE WIT A, VAN DER LINDEN L, et al. Irritable bowel syndrome and visceral hypersensitivity: Risk factors and pathophysiological mechanisms[J]. Acta Gastro-Enterologica Belgica, 2016, 79(1): 29-38. |
| [23] |
VERMEULEN W, DE MAN J G, PELCKMANS P A, et al. Neuroanatomy of lower gastrointestinal pain disorders[J]. World Journal of Gastroenterology, 2014, 20(4): 1005-1020. DOI:10.3748/wjg.v20.i4.1005 |
| [24] |
黄燕, 朱毅, 黄文燕, 等. 针灸治疗肠道疾病内脏痛的实验研究进展[J]. 上海针灸杂志, 2014, 33(11): 1073-1078. |
| [25] |
李媛, 吴凡, 程珂, 等. 激光针灸镇痛效应机制研究进展[J]. 中华中医药杂志, 2018, 33(5): 2125-2131. |
| [26] |
JOHNSON A C, FARMER A D, NESS T J, et al. Critical evaluation of animal models of visceral pain for therapeutics development: A focus on irritable bowel syndrome[J]. Neurogastroenterology and Motility, 2020, 32(4): e13776. DOI:10.1111/nmo.13776 |
| [27] |
SADEGHI R, HEIDARNIA M A, ZAGHERI TAFRESHI M, et al. The reasons for using acupuncture for pain relief[J]. Iranian Red Crescent Medical Journal, 2014, 16(9): e15435. |
| [28] |
吴墨政, 李敬华, 王映辉. 《黄帝内经》中足三里穴的定位及主治功用[J]. 中国中医药图书情报杂志, 2021, 45(2): 60-62. DOI:10.3969/j.issn.2095-5707.2021.02.014 |
| [29] |
周可艳, 管世豪, 袁红, 等. 足三里辅助治疗急性胰腺炎的研究进展[J]. 世界最新医学信息文摘(连续型电子期刊), 2024, 24(16): 10-13. |
| [30] |
潘玫竹, 时静怡, 孙月敏, 等. 基于脑肠互动探析针灸足三里治疗腹泻型肠易激综合征[J]. 辽宁中医药大学学报, 2023, 25(6): 56-60. |
| [31] |
TRYON V L, MIZUMORI S J Y. A novel role for the periaqueductal gray in consummatory behavior[J]. Frontiers in Behavioral Neuroscience, 2018, 12: 178. DOI:10.3389/fnbeh.2018.00178 |
| [32] |
HAHM E T, KIM Y, LEE J J, et al. GABAergic synaptic response and its opioidergic modulation in periaqueductal gray neurons of rats with neuropathic pain[J]. BMC Neuroscience, 2011, 12: 41. DOI:10.1186/1471-2202-12-41 |
| [33] |
HO Y C, CHENG J K, CHIOU L C. Hypofunction of glutamatergic neurotransmission in the periaqueductal gray contributes to nerve-injury-induced neuropathic pain[J]. The Journal of Neuroscience, 2013, 33(18): 7825-7836. DOI:10.1523/JNEUROSCI.5583-12.2013 |
| [34] |
OU S, ZHAO Y D, XIAO Z, et al. Effect of lappaconitine on neuropathic pain mediated by P2X3 receptor in rat dorsal root ganglion[J]. Neurochemistry International, 2011, 58(5): 564-573. DOI:10.1016/j.neuint.2011.01.016 |
| [35] |
XIAO Z, OU S, HE W J, et al. Role of midbrain periaqueductal gray P2X3 receptors in electroacupuncture-mediated endogenous pain modulatory systems[J]. Brain Research, 2010, 1330: 31-44. DOI:10.1016/j.brainres.2010.03.030 |