针刺得气是针刺入穴位后产生的特殊感受和反应，被认为是影响针刺疗效的关键要素之一。患者感知得气为针刺穴位处的酸、麻、重、胀等感觉，医者则为针下沉紧感^[1]。得气与针效的关系古人早有论述，如《灵枢· 九针十二原》云：“刺之要，气至而有效。”《标幽赋》写道：“气速至则速效，气迟至则不治。”都强调了得气对针刺疗效的重要性。现代研究也表明，针刺得气相对于不得气能获得更好的疗效^[2-5]。然而，得气产生的机制以及如何影响针刺疗效的尚不十分清楚。得气是一种主观感觉，需患者口头报告，或医者有针下沉紧感才能感知，因此得气的研究大多基于人体研究，但人体研究所能应用的实验技术和方法有限，如果能明确得气的客观反应，并验证实验动物是否也能呈现，就能建立实验动物得气的研究平台，从而可以应用更加多元的技术和方法来探讨得气产生的机制。目前已有研究表明得气会伴随一些客观反应，如针刺得气时在穴位局部可诱发肌电信号^[6-8]，可检测到毫针牵拉力升高^[9]（这可能是医者针下沉紧感的客观反应），这些研究为客观评价得气提供了一些检测指标和方法，如果针刺实验动物时也能诱发这些客观反应，则可一定程度认为产生了得气，进而建立实验动物得气研究平台，这有助于开展得气的机制及相关基础研究，为得气的应用提供科学依据。

得气是一种主观感觉，感觉的产生与神经系统密切相关。一般认为，得气的产生是针刺的机械刺激直接或间接地兴奋了某些传入神经末梢或感受器，使其发放神经冲动传入大脑，引起酸、麻、胀、重等感觉，同时引起针处的肌肉收缩，使施针者手下产生沉紧感^[10]。然而，哪类传入神经末梢/感受器介导了得气的产生并不十分清楚。已有研究表明针刺得气感的产生主要在肌层^[8]，肌梭是得气感产生的主要感受器^[11-12]。Piezo2是近年来发现的一种机械门控阳离子通道，分布于支配肌梭的感觉神经末梢上，肌梭的机械转导依赖Piezo2通道的激活^[13-14]。据此，笔者推测得气的产生与针刺激活穴区Piezo2通道有关。基于此，研究以前期建立的针刺“足三里”干预完全弗氏佐剂（CFA）诱导的佐剂性关节炎（AIA）大鼠为平台^[15-16]，首先应用两种针刺方式（不行手法和行手法）刺激“足三里”穴，探讨能否诱发实验动物的得气客观反应（穴区肌电信号和毫针牵拉力变化）并产生镇痛效应，以此建立实验动物得气研究平台；同时观察针刺穴位对DRG中表达Piezo2的神经元的激活。由于DRG中感觉神经元的激活源自外周神经末梢的兴奋，因此背根神经节（DRG）中Piezo2神经元的激活，反映的是针刺对穴区Piezo2的激活。在此基础上，进一步于穴区注射Piezo2抑制剂D-GsMTX4再行针刺，观察对得气客观反应及镇痛效应的影响，以探讨穴区Piezo2是否介导了得气客观反应及镇痛效应，为得气产生的机制提供实验依据。

1 材料和方法 1.1 实验动物及分组

本研究由两部分实验组成，实验1，以AIA大鼠炎性痛为效应指标，穴区肌电和毫针牵拉力为得气的客观反应指标，探讨两种针刺方式对得气客观反应和镇痛效应的影响，同时观察针刺DRG中Piezo2神经元的激活情况；实验2，在穴区应用Piezo2通道抑制剂D-GsMTX4，观察抑制剂对针刺诱发的得气客观反应及镇痛效应的影响，明确Piezo2是否介导了针刺得气及镇痛效应。

选取6~7周龄的无特定病原体（SPF）级SD大鼠40只，体质量180~200 g，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK-[京] 2016-0006。饲养环境为湿度（55±5）%，温度（25±1）℃，12 h循环照明，自由摄食饮水。每日将大鼠置于测热痛有机玻璃格中适应2~3 h，持续3 d后，采用足底热辐射测痛仪测量大鼠右足底热痛缩足反应潜伏期（PWL），筛选出痛阈相对稳定的大鼠。在实验1中，将大鼠随机分为模型组、行手法组和不行手法组；在实验2中，大鼠随机分为模型+对照液组、模型+Piezo2抑制剂组、行手法+对照液组和行手法+ Piezo2抑制剂组，每组6只。实验动物通过天津中医药大学实验动物伦理委员会批准（审批号：TCMLAEC2021040）。

1.2 主要仪器及试剂

足底热辐射痛测定仪（中国医学科学院生物医学与工程研究所），Powerlab8/ 35生物电放大器（AD Instruments），力学传感器MLTF050/ST（AD Instruments），生理数据采集分析软件LabChart8.0（AD Instruments），异氟烷气化器VIP3000（MIDMARK），低噪音强力气泵（广州市蓝宝水族科技有限公司），0.35 mm×13 mm一次性无菌环柄针灸针（华佗牌），25 μL注射针（上海高鸽工贸有限公司），石蜡全自动组织包埋机（德国徕卡），手动轮转式石蜡切片机（德国徕卡），烘片仪（德国Leica），移液枪（武汉赛维尔生物科技有限公司），组织包埋盒、包埋模具（南通苏品实验器材有限公司）。

Piezo2 Polyclonal Antibody（赛默飞世尔科技（中国）有限公司），Anti-c-Fos Mouse mAb（武汉塞维尔生物科技有限公司），山羊抗兔IgG H & L（Alexa FluorR 488）（英国Abcam公司），山羊抗小鼠IgG H & L（Alexa Fluor R 594）（英国Abcam公司），DAPI溶液（北京索莱宝科技有限公司），5% BSA封闭液（北京索莱宝科技有限公司），驴血清（北京索莱宝科技有限公司），组织自发荧光淬灭剂A液（武汉塞维尔生物科技有限公司）。

1.3 造模方法

本研究所属团队前期已证实针刺CFA诱导的AIA大鼠“足三里”穴可以有效缓解疼痛^[15-16]，本研究继续沿用这一针刺镇痛平台，探讨得气的作用机制。造模时将大鼠固定于实验台上，用碘伏棉球消毒大鼠右侧足底皮肤，采用1 mL一次性无菌注射器于大鼠右侧足底皮下注射0.1 mL CFA进行造模。

1.4 各组处理方法

行手法组大鼠，穴位定位参考中国针灸学会发布的团体标准——《实验动物常用穴位名称与定位第2部分大鼠》，选取双侧“足三里”穴（膝关节后外侧，在腓骨小头下约3 mm处），采用自制鼠衣束缚大鼠并仰卧位固定于实验台上，暴露双侧“足三里”，使用碘伏消毒后，采用一次性无菌针灸针直刺，进针深度3~5 mm。行手法针刺参数参考课题组前期研究^[16]，即单向捻转3圈以产生沉紧感，后以180次/min频率行捻转法刺激2 min，间隔5 min后再次行针，共4次，每天1次，干预3 d。不行手法组大鼠，进针后留针30 min，不行针，每天1次，干预3 d。Peizo2抑制剂组大鼠，采用微量注射器

分别于双侧“足三里”穴肌层注射20 μL Piezo2抑制剂D-GsMTX4（5 μmol/L），注射时采用“米”字型多向注射，每个方向注射2~3 μL使药液均布分布于穴区肌层组织，D-GsMTX4均当天配备并使用；对照液组大鼠采用同样方式于“足三里”穴处注射等量纯水，20 min后再行相应针刺干预。模型组大鼠不予任何刺激，但给予同针刺时间、同方法的束缚固定。

1.5 观察指标及检测方法

热痛仪检测大鼠足底热痛阈值：每次针刺结束后将大鼠放于玻璃格中静置30 min，采用热痛仪测量大鼠右足底PWL作为热痛阈值，设置上限为50 s，每只大鼠测量3次，每次间隔5 min，计算平均值。

Powerlab8/35多通道生理信号记录仪检测肌电：在第一次针刺时检测，应用气麻机将大鼠麻醉，将记录电极刺入大鼠“足三里”附近的胫骨前肌，深度3~5 mm，距离针刺部位约5 mm，正极位于上方，负极位于下放，地线连接于鼠尾中段。应用LabChart7.0软件采集肌电信号，采集时设置两个通道，通道一为实时肌电信号采集，设置低通滤波1 kHz，高通滤波10 Hz，采样频率1 kHz，通道二为同步计算积分肌电通道值（iEMG），其数据来源于通道一。iEMG是肌电图曲线单位时间内的面积，单位为uV· s，积分类型选择绝对值，重设类型为时间持续衰减0.2 s，选择每个干预节点内稳定的60 s肌电信号所对应的iEGM进行数据分析。记录针刺前2 min以及针刺全程的肌电信号。因本环节麻醉过程中死亡1只大鼠，后续各组随机处死1只大鼠，每组5只进行实验、分析。

Powerlab8/35多通道生理信号记录仪检测毫针牵拉力：应用一根弹力绳穿过针灸针末端环柄并系紧，弹力绳另一端连接拉力传感器，传感器与Powerlab8/35多通道生理信号记录仪相连接。针刺过程中弹力绳为松弛状态，针刺结束后先不出针，将拉力传感器沿针柄方向上调，弹力绳逐渐被拉直并对毫针产生牵拉力，不断缓慢调高传感器，直至毫针被拔出，记录的拉力最大值即为毫针所受牵拉力。

免疫荧光染色法检测大鼠DRG中表达Piezo2的神经元激活比例：取大鼠L4节段DRG组织制作成石蜡切片，脱蜡后放入柠檬酸钠溶液修复盒进行抗原修复，后将切片取出用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗5 min×3次，加自发荧光淬灭剂A液后放入湿盒封闭30 min。因本环节取材中存在技术误差，无法保证每只大鼠均可取材成功，每组3只确保成功取材后进行分析。取出切片用蒸馏水清洗5 min× 3次，后放入湿盒，使用5% BSA封闭30 min。加一抗（PIEZO2 Polyclonal Antibody，1∶200；Anti-c-Fos Mouse mAb，1∶500），4 ℃过夜孵育，甩去一抗静置30 min后，应用PBS静置洗涤5 min×5次，加二抗（1∶400），湿盒避光孵育50 min，之后应用PBS缓冲液静置洗涤5 min×5次。滴加DAPI，避光孵育5~ 7 min，再次用PBS缓冲液静置洗涤5 min×5次，滴加抗荧光淬灭封片剂封片。应用徕卡显微镜观察并采集荧光图像，保存相应荧光图片后，采用人工计数的方法计算Piezo2和c-Fos共表达占Piezo2总数的比例，得到表达Piezo2神经元的激活比例。

1.6 统计学方法

用SPSS 21.0软件对实验结果进行统计学分析，数据用均数±标准差（x±s）表示。大鼠PWL结果采用重复测量方差分析，其余数据若符合正态分布采用单因素方差分析，两两比较时，若方差齐，则采用LSD检验，方差不齐则采用Dunnett’ s t3检验，当不符合正态分布时使用非参数检验，以P < 0.05为差异具有统计学意义的标准。

2 结果 2.1 实验1 2.1.1 不同针刺方式穴区肌电信号的比较

图 1A显示了两种针刺诱发的肌电信号差异，行手法可诱发穴区明显的肌电信号，不行手法组则未出现明显的肌电信号。图 1B对比两组信号的iEMG，结果显示，与不行手法组比较，行手法组在行针时iEMG显著升高（P < 0.01），表明针刺行使手法可以引起“足三里”穴区局部肌电发放。

2.1.2 不同针刺方式对毫针牵拉力的比较

图 2A显示了检测两种针刺方式在出针时的毫针牵拉力；图 2B为毫针牵拉力统计学分析，结果显示，与不行手法组比较，行手法组的毫针牵拉力明显升高（P < 0.01）。毫针牵拉力反应了穴位局部组织对毫针产生的束缚作用，表明针刺行手法可以提高穴区组织对毫针的束缚力，是沉紧感产生的机制之一。

2.1.3 不同针刺方式对足底热辐射痛阈的比较

模型组、行手法组和不行手法组大鼠右足底PWL在造模前无显著差异。造模后24 h，各组大鼠PWL均显著下降，表明AIA大鼠造模成功。与模型组比较，在针刺第1~3天，不行手法大鼠右足底PWL无显著变化，行手法组大鼠右足底PWL明显升高（P < 0.01），表明针刺“足三里”行手法对AIA大鼠具有镇痛效应，不行手法则无镇痛效应，见图 3。

2.1.4 不同针刺方式下DRG中Piezo2阳性神经元激活比例的比较

从图 4可知各组大鼠DRG中均存在Piezo2的表达神经元。进一步比较各组大鼠Piezo2阳性神经元占Piezo2总表达神经元的比例，结果显示，与模型组相比，行手法组Piezo2阳性神经元的激活比例显著升高（P < 0.01）；与不行手法组相比，行手法组DRG中表达Piezo2神经元的激活比例明显升高（P < 0.05）。表明针刺行手法可以激活“足三里”穴相关L4节段DRG中Piezo2离子通道。

上述实验结果表明，针刺行手法组可引发穴区局部肌电发放，使毫针牵拉力升高，这表明行手法组产生了得气样的客观反应，且具有镇痛效应，不行手法则无镇痛效应。因此，针刺行手法可视为针刺产生了得气，故在后续实验中，只采用针刺行手法操作。同时，针刺行手法可激活DRG中表达Piezo2的神经元，因此，实验二中将对Piezo2离子通道进行调控，以明确是否介导了针刺得气客观反应及镇痛效应。

2.2 实验2 2.2.1 穴区注射Piezo2抑制剂对DRG中Piezo2阳性神经元激活比例的影响

比较各组大鼠Piezo2阳性神经元占Piezo2总表达神经元的比例，结果显示，与行手法+对照液组相比，行手法+抑制剂组DRG中Piezo2阳性神经元的激活比例显著降低（P < 0.01），表明穴区注射Piezo2抑制剂阻断了针刺对大鼠L4节段DRG中Piezo2表达神经元的激活，说明该抑制剂有效。见图 5。

2.2.2 穴区注射Piezo2抑制剂对穴区肌电信号的影响

图 6A显示Piezo2抑制剂对行手法诱发肌电信号的影响，行手法+对照液组可诱发穴区肌电信号发放，行手法+抑制剂组则未诱发明显的肌电信号。图 6B显示，与行手法+对照液组相比，行手法+ 抑制剂组行针时积分肌电值明显降低（P < 0.05，P < 0.01），表明行手法所引发的肌电信号可以被Piezo2抑制剂逆转。

2.2.3 穴区注射Piezo2抑制剂对毫针牵拉力的影响

图 7A显示了两种针刺方式在出针时检测的毫针牵拉力，图 7B显示，与行手法+对照液组相比，行手法+抑制剂组毫针牵拉力显著下降（P < 0.01），表明穴区注射Piezo2抑制剂后再进行针刺，毫针牵拉力将不再升高。

2.2.4 穴区注射Piezo2抑制剂对针刺镇痛效应的影响

各组大鼠右足底PWL基础值组间差异无统计学意义，造模后，大鼠足底PWL均下降。与模型+ 对照液组相比，模型+抑制剂组PWL无显著变化，在针刺第2、3天，行手法+对照液组PWL明显升高（P < 0.05），表明抑制剂对模型大鼠足底热痛无显著影响，行手法对模型大鼠可以升高痛阈，产生镇痛效应；与行手法+对照液组相比，在针刺第2、3天，行手法+抑制剂组大鼠PWL降低（P < 0.05），表明穴区注射Piezo2抑制剂后再针刺将不能产生镇痛效应，见图 8。

3 讨论

得气于受针者和施针者都表现为一种特殊的针刺感觉的获得，是一种主观感觉。早期在得气机制研究中，大多基于人体实验开展，结合受试者的主观得气感探讨了得气产生的神经传导机制^[17-18]。此外，在研究中也发现得气时伴随穴区局部的客观反应，包括肌电发放、毫针牵拉力升高和局部血流量升高等^{[8-9, 19]}。如果能在实验动物中采集到针刺诱发的穴区客观反应，就能建立实验动物得气的客观研究平台。考虑到肌电是肌肉收到刺激后产生的兴奋，是一种快反应信号，毫针牵拉力可反应针下沉紧感，而血流变化可能由针刺引起的扩血管物质如组胺、降钙素基因相关肽（CGRP）等的释放相关，信号变化相对缓慢^[20-21]。因此，本研究中选取了穴区肌电和毫针牵拉力作为得气的客观指标，观察在针刺实验动物是否也能诱发。笔者采用了两种针刺方式干预AIA大鼠“足三里”穴，发现行手法组不仅诱发了“足三里”穴区局部的肌电反应，也使毫针牵拉力升高，且具有镇痛效应，而不行手法组则没有上述反应，这表明针刺行手法诱发了得气的客观反应，产生了镇痛效应，据此初步构建了针刺得气的实验动物平台。

针刺行手法可以诱发穴区肌电发放，说明引起了穴区局部肌肉收缩。当肌肉收缩时，肌纤维与针身之间紧密度增加，致使肌肉与针身之间的摩擦力升高。向上牵拉毫针时，毫针牵拉力也相应升高。由此可见，穴区肌电反应和毫针牵拉力之间具有关联性，均与肌肉收缩密切相关。早期有学者检测毫针牵拉力升高，认为与结缔组织缠绕针身有关。该研究在大鼠非穴位处进行针刺，且为单向捻转32圈^[22]，这一操作与针刺临床实践不符。本研究在大鼠“足三里”穴进行针刺，操作方式符合临床实际。据此，倾向于认为针刺时毫针牵拉力升高与针刺诱发穴区肌肉收缩相关。肌肉收缩可加强针刺对肌纤维的牵拉等机械力刺激，进一步激活周围的神经末梢，加强针刺信息传递，上传至大脑皮层产生酸、麻、重、胀得气感，并经过综合调控产生针刺效应。实验结果显示不行手法组并未产生镇痛效应，笔者分析可能是因为单穴不行手法无法达到治疗所需的刺激强度，故镇痛效应不明显。

研究表明，针刺肌肉层相对于皮肤和皮下筋膜层更容易产生得气感^{[8, 23-24]}。穴区肌电发放是得气的客观反应之一，这一反应表明针刺诱发了局部肌肉收缩。肌梭是骨骼肌的主要感受器，介导牵张反射可反射性引起肌肉收缩^[25]。针刺得气引起的肌肉收缩可能与这一过程相关。Piezo2是近年发现的一种机械敏感性离子通道，在肌梭的感觉神经末梢上表达^[14]，是略高于细胞质膜且具有三叶螺旋桨构象排列的跨膜三聚体结构，螺旋桨结构的中心孔道可以传导Ca²⁺为主的非选择性阳离子，当拉伸等机械刺激激活该通道时，螺旋桨叶片将会被拉直，产生能量，引起阳离子从中心孔道内流，诱发机械敏感电流^[26]。小鼠敲除Piezo2会出现本体感觉异常，导致异常肢体位置及肢体活动，且小鼠肌肉对拉伸的响应消失^{[11, 27]}。据此，推测穴区肌层支配肌梭的感觉神经末梢上的机械敏感性离子通道Piezo2是感受针刺机械力刺激的主要感受器，当被针刺激活后，通过牵张反射引起局部收缩诱发了得气相关的客观反应。本研究中检测了DRG中表达Piezo2的神经元的激活情况，发现针刺行手法（即得气）可激活DRG中表达Piezo2的神经元。由于DRG是躯体感觉神经元胞体所在部位，其感受刺激的部位在外周神经末梢，当DRG中神经元被激活时，表明其外周端神经末梢被刺激所激活，这间接表明针刺的机械力刺激激活了穴区局部的Piezo2离子通道。进一步在穴区肌层注射Piezo2抑制剂D-GsMTX4再行针刺操作，结果显示，针刺不能诱发得气客观反应，同时镇痛效应也消失。D-GsMTX4的抑制原理是通过与细胞膜脂质双分子层结合^[28]，抑制细胞膜中Piezo2通道对拉伸等机械刺激的响应，可以较为特异地、剂量依赖性地抑制Piezo2的机械敏感电流^[29]。穴区应用Piezo2抑制剂后，该离子通道不能被针刺捻转的机械力刺激所激活，其后续诱发的由肌梭介导的牵张反射也不能激活，穴区肌肉无法收缩，毫针牵拉力不再升高，得气的客观反应不再显现，进而也抑制了针刺效应的产生。

针刺对Piezo2通道的影响多着眼于病灶部位，如针刺对IBS模型小鼠结肠组织中Piezo2通道的影响^[30-31]、对慢传输型便秘小鼠肠嗜铬细胞中Piezo2通道的影响等^[32]，从穴区局部探讨Piezo2与针刺得气的报道尚无。本研究首次探讨了穴区Piezo2通道与得气的关系，初步证明了穴区Piezo2通道介导了针刺得气客观反应及对AIA大鼠的镇痛效应，表明Piezo2是针刺穴区启动阶段响应机械刺激的关键离子通道之一，这为研究得气的穴区局部机制提供了新思路和见解。得气感为何主要产生在肌层，肌层的哪种神经末梢、通道蛋白介导了得气的产生，这在本研究中得到了初步阐释。得气是影响针刺疗效的关键要素之一，深入揭示其科学基础有助于促进得气的科学应用，这对于提高针刺的应用水平和临床疗效具有重要意义。

研究中选择CFA模型大鼠作为研究对象，是基于前期工作基础已建立的稳定的针刺镇痛效应平台^[15-16]。CFA模型大鼠模拟的是类风湿性关节炎（RA），在急性发作期与人RA非常相似，但该模型的病变具有自限性，炎症高峰期后会出现自行消退，与人RA症状进展性加重特点不符^[33]。但在本研究中，以针刺对急性期疼痛的缓解作为得气的疗效指标，发现针刺得气对CFA模型大鼠具有镇痛效应，这与临床报道的针刺治疗RA缓解疼痛也是一致的^[34]。如若是研究针刺对RA治疗的作用机制，选择其他模型更加适宜，比如胶原诱导性关节炎模型（CIA），它可累及多关节，且体内能检出针对自身Ⅱ型胶原的高滴度的IgG抗体，与人类RA的病理表现更加相似^[35]。

综上，本研究以穴区肌电和针体牵拉力作为评价得气的客观反应指标，构建了针刺大鼠得气的客观反应研究平台，同时，初步明确了穴区Piezo2通道介导了针刺得气客观反应及镇痛效应的产生。本研究也存在以下局限性：针刺对穴区Piezo2的激活提供的是间接证据，即DRG中Piezo2神经元的激活。这是由于常规膜片钳技术对离子通道电流的检测，不适合以针刺作为刺激方式。在前期实验中也采用免疫荧光技术检测了Piezo2的表达，但由于穴区肌层组织自发荧光过强未能有效检测到Piezo2的阳性表达，后续研究我们会进一步改进实验条件，为针刺对穴区局部Piezo2的激活提供更直接的证据。本研究使用的动物模型仅关注了疼痛指标，对其炎症反应未做评估，后续研究中会增加对该指标的评价。CFA诱导的AIA模型并不能完全反应人RA状态，如要探讨针刺对RA的治疗机制，使用CIA模型更加合适。得气是一种普遍现象，得气与针刺疗效也存在普遍的相关性，本研究中仅采用了一种动物模型来探讨Piezo2与得气的关系，后续研究中将针对更多穴位，不同疾病模型开展研究，以进一步明确Piezo2与得气关系的普遍性。此外，Piezo2介导的得气客观反应，如肌肉收缩诱发的肌电反应可能与肌梭介导的牵张反射相关，我们也将在后续研究中进一步探索。