生长板软骨细胞是骨骼生长和发育的关键细胞类型，其增殖和分化过程对骨骼的正常生长至关重要。近年来，研究者们发现微小核糖核酸（miRNA）在调控软骨细胞的增殖和分化中扮演着重要角色，尤其是在Ⅱ型胶原基因（COL2A1）和印度豪猪蛋白-甲状旁腺激素相关蛋白（Ihh-PTHrP）信号通路中^[1-5]。然而，目前关于miRNA在生长板软骨细胞中的具体作用机制尚不完全清楚，限制了人们对骨骼生长调控的深入理解^[6-7]。

骨碎补作为一种传统中药，已经被证实具有促进软骨细胞增殖和抑制炎症作用^[8-9]。尽管已经有研究探讨了骨碎补对软骨细胞的影响，但是大多数研究集中于其总提取物或单一成分，而对其总黄酮部分的研究相对较少^[10-11]。此外，骨碎补总黄酮对miRNA表达的影响及其在软骨细胞增殖中的作用尚未被充分研究^[12-13]。

本研究旨在通过体外实验探讨骨碎补总黄酮对大鼠生长板软骨细胞miRNA表达的影响，以及其对COL2A1和Ihh-PTHrP信号通路的调节作用^[14]。研究开始前假设骨碎补总黄酮通过调控特定miRNAs的表达，进而影响COL2A1的表达和细胞增殖^[15]。为此，采用了噻唑蓝染色（MTT）、实时定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）、酶联免疫吸附（ELISA）和双荧光素酶报告基因实验等方法，以期揭示骨碎补总黄酮在软骨细胞增殖中的潜在机制。

本研究不仅有望为理解骨碎补总黄酮的分子机制提供新视角，而且可能为开发新的治疗策略以促进骨骼生长和治疗相关疾病提供科学依据。此外，本研究的结果也可能为其他中药成分的研究提供参考，推动中药现代化和国际化进程。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物

SPF级SD大鼠4只（雌雄各半，2周龄，体质量40~45 g），购自河南省实验动物中心，动物合格证号：SCXK（豫）2019-0001，收到动物后立即脱颈椎处死进行实验。实验规程及方案符合河南大学动物伦理学审查标准，批准号：HUSOM2024-643。

1.1.2 主要药品与试剂

0.25%胰蛋白酶[含0.02%乙二胺四乙酸（EDTA），Gibco，批号：25200-072]，澳大利亚胎牛血清（FBS，iCell，批号：iCell 0500），DMEM/F12培养基（iCell，批号：iCell-0005），骨碎补提取物（西安开来生物工程有限公司），MTT（碧云天，批号：ST316），胶原蛋白酶Ⅱ（Gibco，批号：17101015），台盼蓝染色液（0.4%，Solarbio，批号：C0040-100 mL），封闭山羊血清（原液，Solarbio，批号：SL038-100 mL），Fluoromount-G（Thermo Fisher Scientific，批号：00-4958-02），Collagen TypeⅡ Antibody（Proteintech，批号：15943-1-AP），CollagenⅡ一抗（1∶100，Abcam，批号：ab34712），甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）一抗（1∶100，ABclonal，批号：A12492），山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）-辣根过氧化物酶（HRP）抗体（1∶500，ABclonal，批号：AS014）。

1.1.3 仪器

生物安全柜（Biobase，型号：BSC-1500ⅡA2-X），恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司，型号：DK-600S），37 ℃恒温细胞培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂，型号：BC-J160S），倒置显微镜（Nikon，型号：DS-Ri2），多功能酶标仪（TECAN，型号：30050303），实时荧光定量聚合酶链式反应（Realtime-PCR）仪（Thermo Fisher Scientific，型号：Applied Biosystems^TM ViiA 7）。

1.2 方法 1.2.1 大鼠生长板软骨细胞分离、培养及鉴定

4只两周龄SD大鼠采用脱颈椎法处死，置于75%乙醇中浸泡5 min。超净工作台内分离四肢，去除皮肤和肌肉组织，剪下胫骨近端生长板软骨并充分剪碎。将软骨置于15 mL无菌离心管内，加入2 mL的1%Ⅱ型胶原酶，在37 ℃水浴锅中振荡消化5 h。消化后，用200目不锈钢滤网过滤，然后以1×10⁵/mL的浓度接种于含10%FBS的DMEM/F12培养基的T25培养瓶中，置于37 ℃、5%二氧化碳（CO₂）培养箱中培养，每2日换液1次。细胞传代后，取对数生长期的细胞1×10⁴个/孔接种于24孔板进行爬片培养。爬片结束后，吸出培养基，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗，并加入1 mL的4%可溶性聚四氟乙烯（PFA）在4 ℃条件下固定30 min。固定后，用PBS洗涤3次，每次5 min。随后取玻片，封闭后加入一抗（Collagen Type Ⅱ Antibody，PBS稀释200倍）于4 ℃过夜孵育。避光条件下加入二抗[CoraLite594-conjugated Affinipure山羊抗兔IgG（H+L），PBS稀释500倍]孵育2 h，再用PBS洗涤3次，每次5 min。4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色5 min（DAPI=1∶1 000），随后用PBS洗涤3次，每次5 min。最后在玻片上滴加1滴Fluoromount-G荧光封片剂封片，在荧光显微镜下进行观察。

1.2.2 MTT法筛选骨碎补总黄酮促进大鼠生长板软骨细胞增殖的最适药物浓度

将处于对数生长期的大鼠生长板软骨细胞以1×10⁴个细胞/孔的密度接种到96孔板中，在37 ℃、5%CO₂的培养箱中培养直至细胞贴壁。随后，细胞被分为空白对照组（不添加骨碎补总黄酮）以及分别添加20、50、100、175、250、375、500 mg/L骨碎补总黄酮的实验组。每组设置6个复孔。各组在37 ℃、5%CO₂的培养箱中继续培养24 h，取出96孔板，每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，继续培养4 h。然后，取出96孔板，吸除培养基，每孔加入150 μL甲臜溶液，置于摇床上低速振荡30 min，充分溶解结晶物。最后，使用酶标仪在570 nm波长处测量各孔吸光度值，并对实验结果进行分析。

1.2.3 实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）法筛选抑制PTHrP表达的最佳质粒

将对数生长期的大鼠生长板软骨细胞按照0.5×10⁶个细胞/孔的密度接种于96孔板，在37 ℃、5%CO₂的培养箱中培养直至细胞贴壁，进行质粒转染实验。将4种质粒甲状旁腺蛋白重组蛋白（PTHLH）-Rat-280、PTHLH-Rat-439、PTHLH-Rat-UTR-688、PTHLH-Rat-UTR-782加入减血清培养基中，再加入适量的P3000试剂进行稀释，轻柔混匀。将脂质体3 000转染试剂加入减血清培养基，轻柔混匀。然后，将稀释好的质粒溶液逐滴加入脂质体3 000转染试剂稀释液中，轻柔混匀，室温静置15 min。随后，将上述4种混合物分别加入细胞培养液中，在细胞培养箱中孵育24 h。每组设置3个复孔。24 h后，提取细胞总核糖核酸（RNA），逆转录为互补脱氧核糖核酸（cDNA），以GAPDH为内部参照，进行聚合酶链式反应（PCR）检测：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。记录循环阈值（Ct值），采用2^－△△Ct方法比较各样品间PTHrP的表达差异。

1.2.4 ELISA法观察骨碎补总黄酮和PTHrP对培养的大鼠生长板软骨细胞中COL2A1表达的影响

将大鼠生长板软骨细胞按照1×10⁴个细胞/孔的密度接种于96孔板中，设置如下实验组：空白组（加入普通培养基，即含90 μL的90%DMEM+10%FBS的完全培养液）、骨碎补总黄酮组（普通培养基中加入250 mg/L的骨碎补总黄酮）、Ihh-PTHrP通路组（普通培养基中加入30 μg/mL的PTHrP）、PTHrP抑制组（普通培养基中加入PTHLH-Rat-280质粒）、骨碎补总黄酮+PTHrP组（普通培养基中加入250 mg/L的骨碎补总黄酮和30 μg/mL的PTHrP）、骨碎补总黄酮+PTHrP抑制组（普通培养基中加入250 mg/L的骨碎补总黄酮和PTHLH-Rat-280质粒）。每个实验组设置6个复孔。在37 ℃、5%CO₂的培养环境中孵育24 h。然后，每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃孵育4 h，采用ELISA法测定各组COL2A1的表达水平。

1.2.5 MTT法观察骨碎补总黄酮和PTHrP对大鼠生长板软骨细胞增殖的影响

大鼠生长板软骨细胞以每孔1×10⁵个细胞的密度接种到96孔细胞培养板中。当细胞生长至约80%的汇合度时，根据“1.2.4”项的比例将其分为不同组别，并分别加入相应药物进行处理。处理后的细胞在37 ℃且含有5%CO₂的恒温培养箱中继续培养24 h。培养结束后，将96孔板取出，向每孔中加入20 μL的MTT溶液（浓度为5 mg/mL），然后再次放入培养箱中继续培养4 h。

随后，取出96孔板，吸净孔中的培养基，向每孔加入150 μL的甲臜溶液。将96孔板置于摇床上，低速振荡30 min，确保结晶物完全溶解。最终，使用酶标仪在570 nm波长条件下测定各孔吸光度值，并分析实验结果。

1.2.6 生物信息学预测与RT-qPCR法验证调控COL2A1的miRNA

利用miRWalk网站（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）查询能够调控COL2A1的miRNA，并通过RT-qPCR方法检测这些miRNA在骨碎补总黄酮组和空白对照组提取的上清液中的差异表达情况。具体步骤如下：使用总RNA提取试剂（Trizol试剂）提取上清液中的总RNA，采用Taqman microRNA RT Kit进行逆转录，以U6作为内部参照基因，检测这些miRNA的相对表达量。引物设计使用Primer Premier 5.0软件完成。逆转录成cDNA后，使用SYBR Green PCR MasterMix作为核酸染料，配制反应体系，并将待测基因反应体系加入其中。在Realtime-PCR仪中进行扩增，记录Ct值，采用2^－△△Ct方法比较不同样品间的表达差异。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验验证上述筛选的miRNA与COL2A1的调控关系

预测并筛选与COL2A1结合的miRNA位点后，根据这些位点设计靶序列与突变序列，并添加酶切位点。通过PCR法合成目标片段，分别构建COL2A1-3’UTR的野生型（WT）和突变型（MUT），然后克隆至pmirGLO载体中。将miRNA模拟物与pmirGLO-COL2A1-WT或MUT重组质粒共转染293T细胞，使用miRNA scramble阴性对照与COL2A1的野生型或突变型重组质粒共转染作为对照组。在37 ℃、5%CO₂的培养条件下孵育48 h，更换为1 mL含10%FBS但不含抗生素的DMEM培养基，继续培养48 h，随后裂解细胞。每组取5 μL细胞裂解液，以海肾荧光值作为内部参照，检测各组的相对荧光强度。通过比较COL2A1突变组与野生组的荧光强度，观察突变组是否较野生组荧光强度增大，以证明miRNA与COL2A1可以有效结合。

1.2.8 体外细胞实验证实筛选的miRNA调控COL2A1蛋白表达

将上述培养的细胞分为空白对照组（普通培养基培养）、骨碎补总黄酮组（培养基中加入250 mg/L的骨碎补总黄酮）、miRNA模拟物组（培养基中加入50 μmol/L的miRNA模拟物）、miRNA抑制剂组（培养基中加入50 μmol/L的miRNA抑制剂）。干预结束后，通过蛋白免疫印迹（Western blot）法检测细胞上清液中COL2A1的表达丰度。具体步骤如下：收集各组细胞上清液，使用二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度。取适量蛋白样品，加入5×SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）进行电泳分离。电泳结束后，将蛋白转移至膜上。使用含70 g/L脱脂奶粉的Tris-Hcl缓冲盐溶液（TBST）在摇床上封闭2 h。封闭结束后，用1×TBST充分漂洗（每次5 min，共3次），然后加入稀释比例为1∶1 000的兔抗鼠COL2A1多克隆抗体，在4 ℃摇床上孵育过夜。再次充分漂洗后，加入稀释比例为1∶1 000的山羊抗兔二抗，在室温摇床上孵育2 h。最后，充分漂洗，采用化学发光法显色。使用Alpha软件分析条带的光密度值，以GAPDH作为内部参照，检测COL2A1的蛋白表达水平。

1.2.9 统计学分析

将数据录入Excel，并使用SPSS 22.0进行统计学分析。对于骨碎补总黄酮药物浓度筛选、质粒筛选、骨碎补总黄酮及Ihh-PTHrP通路对大鼠生长板软骨细胞增殖的比较、骨碎补总黄酮及Ihh-PTHrP通路对大鼠生长板软骨细胞中COL2A1表达的影响，以及药物和miRNA对培养的生长板软骨细胞中COL2A1表达的影响、双荧光素酶报告基因实验，均采用单因素方差分析。组间比较使用LSD法。对于骨碎补总黄酮组和空白对照组之间差异表达miRNA的检测，采用t检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 大鼠生长板软骨细胞培养及鉴定结果

在倒置显微镜下观察，刚接种的未贴壁细胞呈小圆球形，悬浮于培养液中；培养12 h后，细胞开始贴壁；培养24 h后，大部分细胞已贴壁，细胞形态发生变化，多呈圆形或椭圆形，延伸形成伪足，均匀散布生长，出现较多细胞分裂象；培养3~5 d，软骨细胞90%融合形成单层，细胞形态不规则，呈多边形或星形，胞体丰富，胞质均匀，细胞间相互密集连接，呈“铺路石”状外观。见图 1。

培养72 h后进行免疫荧光实验，以鉴定软骨细胞的特定标志物Ⅱ型胶原。结果显示，在荧光倒置相差显微镜下，可见典型软骨细胞形态，经DAPI染色后细胞核呈现蓝色荧光，细胞质呈现绿色荧光，证明该实验方法能够分离并培养出高纯度软骨细胞。见图 2。

2.2 筛选骨碎补总黄酮药物最佳浓度

各浓度的骨碎补总黄酮对细胞增殖的促进效果随浓度增加呈梯度增长。20、50、100、175、250、375 mg/L的骨碎补总黄酮对细胞增殖的促进作用均高于空白对照组，其中250 mg/L效果最好。当浓度达到500 mg/L时，细胞增殖反而低于250 mg/L。因此，250 mg/L是骨碎补总黄酮促进细胞增殖的最佳浓度。见表 1。

2.3 质粒筛选结果

4种质粒转染细胞后，PTHLH-Rat-280质粒转染组的PTHrP表达量最低，与其他3组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。因此，选择PTHLH-Rat-280质粒作为PTHrP的抑制剂。见表 2。

2.4 骨碎补总黄酮及Ihh-PTHrP通路对大鼠生长板软骨细胞中COL2A1的影响

骨碎补总黄酮组和骨碎补总黄酮+PTHrP组细胞中COL2A1表达量高于空白对照组（P < 0.01），而PTHrP抑制剂组的COL2A1表达量低于骨碎补总黄酮组（P < 0.01），提示骨碎补总黄酮和Ihh-PTHrP通路均能够促进生长板软骨细胞中COL2A1的表达。见表 3。

2.5 MTT实验结果

骨碎补总黄酮组、Ihh-PTHrP通路组及骨碎补总黄酮+PTHrP组、骨碎补总黄酮+PTHrP抑制组均可以促进细胞增殖，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。PTHrP抑制组的细胞增殖情况较骨碎补总黄酮组、Ihh-PTHrP通路组及骨碎补总黄酮+PTHrP组、骨碎补总黄酮+PTHrP抑制组降低，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表 4。

2.6 生物信息学分析

miRWalk网站查询结果提示miR-3074、miR-125b-2-3p、miR-29-5p均可以调控COL2A1表达。将中药组与空白对照组中以上几种miRNA进行RT-qPCR检测，结果显示miR-125b-2-3p和miR-29-5p在两组中表达的差异具有统计学意义（P < 0.05）。而miR-3074在两组中表达的差异无统计学意义（P>0.05）。遂选取miR-125b-2-3p进行下一步实验。

2.7 双荧光素酶报告基因实验证明miR-125b-2-3p调控COL2A1表达

COL2A1 MUT的荧光值相对表达高于WT（P < 0.01），表明野生型COL2A1能够与miR-125b-2-3p结合，从而抑制荧光出现，而在COL2A1突变后，miR-125b-2-3p无法与之结合，导致标记的荧光出现，证明miR-125b-2-3p可以直接与COL2A1结合，从而调控其表达。见图 3及图 4。

2.8 药物和miR-125b-2-3p对培养的生长板软骨细胞中COL2A1表达的影响

骨碎补总黄酮组和miR-125b-2-3p抑制剂均能够引起培养的生长板软骨细胞中COL2A1的表达升高，而miR-125b-2-3p模拟物则引起培养的生长板软骨细胞中COL2A1表达下降。见图 5。

3 讨论

骨骼生长发育的生理基础是生长板干细胞及软骨细胞的增殖与分化，受众多信号通路、生长因子或激素的调节，其调控机制相对复杂。COL2A1作为体内诱导骨和软骨形成的主要因子，是转化生长因子-β1（TGF-β1）家族中的一种多功能细胞因子，与骨代谢密切相关^[16-17]。COL2A1在骨形态发生蛋白家族成员中活性最高，能够促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨细胞分化，促进骨形成及骨血管生成，对肢体生长、软骨内骨化、骨折早期软骨修复具有重要作用。相关研究表明COL2A1缺失会导致骨生成受阻或骨病、骨折^[18-19]。

中医药应用骨碎补治疗骨科疾病历史悠久，唐代骨伤医家蔺道人在其所著《仙授理伤续断秘方》中记载了大量包含骨碎补的骨伤科中药复方。现代常用的骨伤科中成药，如强骨胶囊、接骨续伤散、骨质增生丸、健骨颗粒等的主要原料即为骨碎补^[20]。现代药理研究表明，骨碎补具有诱导成骨分化的潜力，并且没有明显的毒副作用，药用价值显著^[21]。骨碎补化学成分丰富，主要包括黄酮类、三萜类、酚酸类等^[22]，骨碎补总黄酮是骨碎补中黄酮类的总称，是从中药骨碎补中提取的有效成分，主要含有二聚物和三聚物类、黄酮类、三萜、酚酸及苷类化合物。经检索相关文献发现，黄酮类化合物的相关报道最多，其中以骨碎补总黄酮及骨碎补黄酮类活性单体化合物柚皮苷为主。总黄酮为骨碎补的主要活性成分，文献报道其不仅可以促进成骨细胞增殖，还能降低破骨细胞活性，增加骨密度，改善骨质量，抑制骨吸收，促进骨缺损愈合^[23]。骨碎补活性成分可以有效促进骨损伤部位骨细胞的增殖分化，促进成血管-成骨偶联，调节骨代谢，加快骨钙沉积矿化，诱导骨组织修复重建，在骨组织再生领域具有较高的研究价值^[20]。曾志奎等^[24]通过动物实验证实骨碎补总黄酮可以通过上调H型血管表达增强成血管-成骨作用，提高大鼠股骨Masquelet诱导膜模型成骨效能，促进骨重建。申晓靖等^[25]通过动物实验探讨了骨碎补总黄酮对牙槽骨成骨细胞增殖和凋亡的影响及其机制，认为其可以作为潜在的口腔工程和骨整合的新型候选药物。申震等^[26]还发现，骨碎补总黄酮无论是以局部载药释放方式还是灌胃给药方式均可联合β-磷酸三钙材料支架促进缺损区新骨生成，对大段骨缺损修复产生积极作用。也有学者通过动物实验证实骨碎补总黄酮和柚皮苷均对牵张成骨的愈合具有促进作用，而总黄酮的效果比其成分柚皮苷更为显著^[27]。

骨碎补总黄酮还可以通过雌激素通路、谷氨酸通路、印度刺猬蛋白（Ihh）通路等调节骨代谢平衡。研究发现骨碎补总黄酮通过Ihh信号通路上调相关因子表达，从而发挥促进BMSCs增殖和成骨分化作用^[28]。骨碎补活性成分能够在不同环境增强BMSCs的成骨分化能力。骨碎补活性成分还可以改善不同环境和状态下成骨细胞活力^[20]。本研究发现骨碎补总黄酮和PTHrP均对大鼠生长板软骨细胞的增殖具有促进作用，而PTHrP抑制剂对大鼠生长板软骨细胞的增殖具有抑制作用。当同时给与骨碎补总黄酮和PTHrP，大鼠生长板软骨细胞增殖效果较单独给予骨碎补总黄酮或PTHrP更加明显，而同时给予骨碎补总黄酮和PTHrP抑制剂较单独给予骨碎补总黄酮或PTHrP，大鼠生长板软骨细胞的增殖受到抑制。以上结果说明骨碎补总黄酮对大鼠生长板软骨细胞增殖的效果是通过干预PTHrP实现的。而COL2A1作为Ihh-PTHrP通路的重要节点因子，骨碎补总黄酮对其干预效果也呈现相似作用。

miR-125b-2-3p在空白对照组和骨碎补总黄酮组分别培养的细胞上清液中呈现差异表达，同时生物信息学与双荧光素酶报告基因实验结果也证实miR-125b-2-3p和COL2A1之间存在调控关系。进一步研究发现骨碎补总黄酮和miR-125b-2-3p抑制剂对COL2A1的表达存在促进作用，而miR-125b-2-3p模拟物对COL2A1的表达具有抑制作用。这些研究提示骨碎补总黄酮可以通过干预大鼠生长板软骨细胞中的miR-125b-2-3p调控Ihh-PTHrP通路COL2A1的表达，从而促进细胞增殖。

人类生长板是未成年时期的特有结构，是骨骼生长发育的重要部位，一旦损伤，会影响骨骼生长发育，造成骨骼生长停止或骨骼生长畸形等后果。本研究的意义在于骨碎补总黄酮可以通过miR-125b-2-3p调控Ihh-PTHrP通路的COL2A1，干预与生长板软骨细胞增殖相关的多种疾病，证实中药骨碎补总黄酮可以多靶点干预疾病，为中药的现代化研究提供新思路。