血管性痴呆（VaD）是脑血管病变及其危险因素导致的卒中或血管性脑损伤，是继阿尔茨海默病（AD）后导致认知功能下降的第二大常见原因，具有发病率高、危害严重等特点^[1]。VaD病因复杂，临床表现多样，有研究认为神经炎症是VaD发病的重要机制，小胶质细胞激活并诱导的神经炎症反应是VaD认知功能损伤的重要原因^[2-4]。小胶质细胞分泌大量的炎症介质，如白细胞介素（IL）-1β可以促进中枢神经系统的炎症反应并加速神经元死亡，而抗炎因子IL-10的水平升高有利于逆转神经元受损并减轻认知功能障碍^[5-7]。因此，调节小胶质细胞介导的炎症反应可能成为治疗VaD的新策略。目前，VaD的西药治疗需要更多的循证医学证据以证实其长期治疗效果，且存在一定不良反应。近年来，中药通过抑制神经炎症防治VaD具有较为明显的优势^[8-11]。李小黎教授总结多年临床经验，自拟颐脑通络方能够有效提高VaD患者认知功能，但其具体作用机制和靶点尚未阐明。本研究拟从小胶质细胞介导的神经炎症反应角度探讨颐脑通络方不同剂量改善VaD的作用机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物

本实验动物选择SPF级7周龄健康雄性SD大鼠70只，体质量230~250 g，购自斯贝福生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0010。动物饲养于北京中医药大学北京中医药研究院动物实验中心。饲养温度为25~26 ℃，相对湿度为50%~60%，人工维持光照明暗各12 h，动物可以自由摄取标准饲料和水，清洁玉米芯垫料定期更换。实验过程中对动物的处置已经通过北京中医药大学北京中医药研究院动物实验中心动物伦理审查委员会审查，伦理编号：BUCM-2025032007-1190。

1.2 药物、试剂及仪器

颐脑通络方配方颗粒购自北京中医药大学第三附属医院，药物厂家为北京康仁堂公司，其组成包括熟地黄、葛根、黄连等。盐酸多奈哌齐片：卫材（中国）药业有限公司，批号：国药物准字H20050978。戊巴比妥钠（广州化学试剂厂）、硫酸庆大霉素注射液（国药集团容生制药有限公司，批号：H41020609）、4%多聚甲醛溶液（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0099）、酶联免疫吸附（ELISA）IL-1β试剂盒（南京建成科技有限公司，批号：H002-1-2）、ELISA IL-10试剂盒（南京建成科技有限公司，批号：H009-1-2）、抗CD68抗体（abcam，批号：ab283654）、抗离子钙结合适配器分子1（Iba1）抗体（abcam，批号：ab283319）、山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）H&L（abcam，批号：ab150113）、山羊抗兔IgG H&L（abcam，批号：ab150080）、柠檬酸抗原修复液（Servicebio，批号：G1202）、封闭用正常山羊血清原液（Jinpan，批号：BL1097A）。水迷宫设备（江苏赛昂斯生物科技有限公司）、RM2016莱卡轮转式切片机（德国莱卡公司）、LSM880倒置荧光显微镜（德国ZEISS公司）。

1.3 大鼠模型建立

大鼠适应性饲养1周后，根据随机数字表在70只大鼠中选择9只作为假手术组，剩余大鼠行双侧颈总动脉结扎手术（2-VO）建立模型^[12]。术前8 h禁食、不禁水。大鼠按照40 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉，角膜反射消失视为麻醉成功。将大鼠以仰卧姿势固定置于带有加热垫的手术台上，以维持术中大鼠体温。剔除颈部中央毛发、碘伏消毒后手持组织剪从颈部中线纵向剪开1.5~2.0 cm，缓慢钝性分离颈部皮下组织及肌肉群使颈总动脉充分暴露，双手各持眼科镊将颈总动脉上附着的神经纤维与血管小心分离。使用5-0号缝合线于颈总动脉处结扎，剪掉多余丝线，另一侧颈总动脉按照相同方法处理。结扎完成后，颈部肌肉滴注硫酸庆大霉素注射液预防感染并缝合，回笼保温观察等待其苏醒。假手术组不结扎血管，其余操作同模型组。造模后连续观察7 d。造模及观察饲养期间假手术组大鼠无死亡，模型组死亡16只，剩余45只。

1.4 分组及干预

剩余45只大鼠采用随机数字表法分为模型组、西药组、中药低、中、高剂量组，每组9只。假手术组大鼠9只。模型组及假手术组给予生理盐水10 mL/kg，中药中剂量组的给药剂量按照60 kg成年人体质量的6.25倍计算，结果为12.4 g/kg^[13]，中药低、高剂量组给药剂量分别是中药中剂量组的0.5倍和2倍，分别为6.2 g/kg和24.8 g/kg，西药组给予盐酸多奈哌齐片0.52 mg/kg。各组均连续灌胃28 d。干预结束后对大鼠进行水迷宫实验，取大鼠脑组织。

1.5 观察指标及检测方法 1.5.1 Morris水迷宫实验

水迷宫设备参数：直径120 cm，高50 cm，水深30 cm，水温（26±1）℃。水池周围以帘子遮挡，防止外界声光因素对大鼠形成干扰。实验前1 d将大鼠从任一象限放入水中，任其游泳60 s，进行适应性训练。正式实验包括定位航行实验和空间探索实验，具体操作方法参照参考文献^[14]。采用digbehv animal分析处理软件记录大鼠的游泳轨迹、游泳速度、逃避潜伏期、平台所在象限时间、平台所在象限路程。

1.5.2 苏木精-伊红（HE）染色

大鼠脑组织行石蜡包埋、切片、脱蜡、冲洗、HE染色、洗涤封片，200倍光学显微镜下观察左侧脑组织病理变化。

1.5.3 ELISA实验

检测大鼠左侧海马组织中IL-1β、IL-10水平，取新鲜海马组织加入试剂盒，按照说明书进行操作。

1.5.4 免疫荧光

观察大鼠左侧海马组织，脑组织经固定、脱水、0.3%的TritonX-100溶液透膜、10%山羊血清封闭、抗CD68抗体、抗Iba1抗体、山羊抗小鼠IgG H&L、山羊抗兔IgG H&L抗体孵育、正置荧光显微镜下拍照并分析。

1.6 统计学分析

所有数据采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），并用post-hoc检验中的LSD法（方差齐时）或Dunnett’s T3（方差不齐时）进行组间多重比较。当检验变量不服从正态分布时，采用非参数统计中的Kruskal-Wallis检验。以双侧检验P < 0.05作为判断差异具有统计学意义的标准。

2 结果 2.1 颐脑通络方对大鼠学习、记忆能力的影响

定位航行实验中，各组大鼠游泳速度比较，差异无统计学意义（P > 0.05），可以排除大鼠运动能力对本次实验的影响。各组大鼠连续5 d的逃避潜伏期逐渐缩短，说明通过连续训练，大鼠对空间平台的记忆逐渐形成。与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期增加（P > 0.05）；与模型组比较，西药组及中药低、中、高剂量组逃避潜伏期缩短（P > 0.05）。见图 1。

空间探索实验中，与假手术组比较，模型组原平台所在象限路程百分比减少（P < 0.05），原平台所在象限时间百分比减少（P < 0.05）；与模型组比较，西药组原平台所在象限路程百分比增加（P < 0.05），中药低、中、高剂量组原平台所在象限路程百分比增加（P > 0.05），西药组、中药高剂量组原平台所在象限时间百分比增加（P < 0.05），中药低、中剂量组原平台所在象限时间百分比增加（P > 0.05）。见图 2。

2.2 颐脑通络方对大鼠海马组织形态的影响

假手术组大鼠海马组织神经元数量多、细胞层结构完整、排列紧密、细胞形态正常。模型组神经元数量减少，锥体细胞丢失，细胞层结构疏松，排列紊乱，细胞核固缩。西药组、中药组与模型组比较，神经元损伤程度减轻，神经元数量增多，排列整齐，细胞较为完整。见图 3。

2.3 颐脑通络方对大鼠海马组织炎性因子含量的影响

与假手术组比较，模型组IL-1β含量增加（P < 0.05），IL-10含量减少（P < 0.05）；与模型组比较，西药组及中药低、中、高剂量组IL-1β含量减少（P < 0.05），IL-10含量增加（P < 0.05）。见图 4。

2.4 颐脑通络方对大鼠海马组织小胶质细胞激活的影响

与假手术组比较，模型组CD68⁺小胶质细胞含量增加，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，西药组、中药高剂量组CD68⁺小胶质细胞含量减少，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，中药低、中剂量组CD68⁺小胶质细胞含量减少，但差异无统计学意义（P>0.05）。见图 5、图 6。

3 讨论

中医无VaD病名，而VaD是由脑血管功能障碍导致的记忆、认知和行为出现异常的认知障碍性疾病，故据此可以将其归属于中医“善忘”“痴呆”“健忘”“呆病”范畴。李小黎教授认为本病的关键病机为肾精亏虚、痰瘀互结。肾主骨生髓，肾精亏虚则髓海不足，王清任《医林改错》记载：“高年无记性者脑髓渐空。”又《类证治裁》云：“脑为元神之府，精髓之海，实记性之所凭也，老人健忘者，髓海渐空也。”^[15]因此，肾精亏虚是VaD发病之本。陈士铎强调：“痰积于脑中，盘踞于心外，使神明不清，而成呆病。”《石室秘录·痴呆》记载：“痰势最盛，呆气最深。”脑为元神之腑，且脑络细小，痰瘀阻络，必致神明功能障碍。可见，VaD以肾虚之本，易出现痰浊、瘀血之标。治疗时主张补肾益精、祛痰通络以补泻兼施，据此创立颐脑通络方。方中熟地黄、酒苁蓉为君，熟地黄滋阴益精填髓，酒苁蓉温补肾阳，两药合用发挥肾阴阳双补之效；臣药石菖蒲祛痰开窍益脑，黄芪益气健脾化痰，川芎活血化瘀，全蝎、土鳖虫搜剔通络，合用共奏祛瘀通络之效；佐药黄连、葛根清热以消痰瘀生热之弊。诸药合用，共奏补肾益精、祛痰通络之效。

2-VO术后慢性脑灌注不足会导致海马组织尤其是CA1区损伤，对认知功能产生损害，因此本研究选择2-VO建立大鼠模型^[16]。实验中通过Morris水迷宫实验发现颐脑通络方低、中、高剂量组大鼠学习、记忆能力提升，病理结果表明颐脑通络方低、中、高剂量组能够修复VaD大鼠海马组织神经元损伤，以颐脑通络方高剂量组效果最为显著，提示颐脑通络方能够有效改善VaD大鼠认知功能障碍，且高剂量组效果最佳。

神经炎症是脑缺血后继发性脑损伤的重要因素，缺血性脑损伤后，脑内小胶质细胞和因血脑屏障受损而渗入中枢神经系统的巨噬细胞会迅速迁移至炎症部位。在受损环境中，这些细胞被激活并分泌大量炎症介质与活性氧，如IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和一氧化氮（NO），促进中枢神经系统的炎症反应并加速神经元死亡^[17]。在神经炎症恢复期，通过上调精氨酸酶-1（Arg-1）、类几丁质样酶1（Ym1）、IL-4、IL-10和转化生长因子-β（TGF-β）等抗炎因子，可以抑制由于过度炎症而造成的突触损伤并促进轴突再生^[4]。因此，在神经炎症初期通过减少小胶质细胞的激活，从而减少其炎性因子释放，增加脑组织内抗炎因子含量可能成为治疗VaD的新策略。研究发现在脑低灌注条件下，啮齿类动物脑内小胶质细胞过度活化，炎症机制通过神经胶质细胞激活和促炎性IL增加破坏了脑血管的完整性并加重认知功能障碍^[18-20]。本研究结果显示模型组大鼠IL-1β含量增加，IL-10含量减少。颐脑通络方能够调控海马组织的炎症反应，显著减少VaD大鼠海马组织促炎因子IL-1β含量，增加抗炎因子IL-10含量，以颐脑通络方高剂量组效果最为显著。Iba-1蛋白是小胶质细胞的标志物，CD68是激活的小胶质细胞标志物，CD68⁺/Iba-1⁺共表达的小胶质细胞代表了激活的小胶质细胞^[21-22]。本研究中，模型组大鼠的小胶质细胞显著激活，而颐脑通络方低、中、高剂量组激活的小胶质细胞含量减少，以颐脑通络方高剂量组最为明显，说明颐脑通络方能够抑制小胶质细胞激活。

综上所述，颐脑通络方可以通过抑制慢性脑灌注不足条件下小胶质细胞激活及其诱导的炎症反应，提高抗炎因子从而抑制神经炎症，达到改善VaD认知功能障碍效果。本研究为进一步阐明颐脑通络方治疗VaD神经炎症的作用机制提供了方向，后期将从小胶质细胞极化角度探讨颐脑通络方治疗VaD的潜在机制。