糖尿病肾病（DKD）是一种由慢性高血糖引起的肾脏损伤，已经成为终末期肾病（ESRD）的主要原因^[1]。据估计，全世界范围内由DKD引发的ESRD病例至少占ESRD的1/3^[2]。在临床上，DKD最初表现为肾小球高过滤，随后出现微量白蛋白尿。随着病情进展，患者会出现大量蛋白尿，肾小球滤过率下降，肾功能逐渐衰退，最终发展成ESRD^[3]。足细胞是高度特化的终末分化细胞，作为肾小球滤过的最后一道屏障，其结构和功能的完整性直接影响蛋白尿程度。因此，足细胞在DKD的发生和发展中扮演着重要角色^[4-5]。细胞焦亡是一种炎症性、程序性细胞死亡形式，是导致足细胞损伤的重要机制^[6]。足细胞损伤的主要表现包括足细胞肥大、裂膜关键蛋白（如nephrin和podocin）丧失，以及足突（FPs）消失和脱离^[7-8]。因此，调控足细胞的焦亡可能成为改善DKD肾损伤的重要治疗靶点。中医认为DKD的临床治疗主要注重滋阴养津、解毒消肿。近年来，人们对中药处方在DKD治疗中的疗效和机制、中草药及其活性成分在新药开发方面的潜力给予了广泛关注^[9]。本研究选用的三黄益肾胶囊是由第六批全国老中医药专家学术经验继承工作指导老师苏秀海主任医师和河北省著名中医王元松教授的经验方转化而来。针对DKD早期脾肾气阴两虚伴瘀血的病机，提出“益气养阴，健脾补肾，活血通络”的治疗策略^[10]。因此，文章旨在探讨三黄益肾胶囊能否延缓肾脏细胞焦亡，减轻DKD损伤，为治疗DKD提供新方向。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

三黄益肾胶囊组成：黄芪、西洋参、山药、山茱萸、菟丝子、黄精、生地黄、芡实、金樱子、益母草、丹参、川芎、苍术、赤芍、王不留行，为河北省沧州中西医结合医院院内制剂（冀药制字Z20050795）；卡托普利（Cap，批号：HY-B0368）、链脲佐菌素（STZ，批号：HY-13753）、柠檬酸钠缓冲液（批号：HY-B1610N）均购自MedChemExpress公司；生理盐水购自石家庄四药有限公司（批号：H13023200）；异戊巴比妥钠购自上海上药新亚药业有限公司（批号：H31021725）；尿蛋白定量试剂盒（批号：C035-2-1）、肌酐测定试剂盒（批号：C011-2-1）、尿素氮测定试剂盒（批号：C013-2-1）、总胆固醇测定试剂盒（批号：F002-1-1）、三酰甘油测定试剂盒（批号：F001-1-1）、低密度脂蛋白测定试剂盒（批号：A113-2-1）购自南京建成生物工程研究所；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）抗体（批号：3866S）购自美国Cell Signaling Technology公司；突触足蛋白（Synaptopodin，批号：ab259976）购自英国abcom公司。

1.2 动物模型建立、分组及给药

选取健康SPF级4周龄雄性C57BL/6小鼠40只，体质量（20±2）g，均由山东恒荣生物科技有限公司提供，饲养于河北省沧州中西医结合医院实验室（SPF级）。光/暗循环12 h，恒温（22±2）℃，湿度（55±10）%。动物实验经河北省沧州中西医结合医院伦理委员会批准，符合《实验动物护理使用指南》。所有小鼠均适应性喂养1周。建立模型前随机分为两组，正常组（8只）与模造组（32只）。造模组小鼠连续喂养高脂饲料7周，第7周结束后腹腔注射STZ 120 mg/kg[0.1 mmol/L柠檬酸钠缓冲液（pH为4.4）配制成1%的STZ溶液]，注射前12 h禁食不禁水。72 h后尾静脉取血检测空腹血糖，空腹血糖≥ 16.7 mmol/L提示糖尿病模型建立成功^[11-12]。继续喂养1周，1周后使用代谢笼收集小鼠尿液，检测24 h尿蛋白水平，尿蛋白水平≥ 30 mg/24 h判定为DKD模型成立^[13]。模型成立后，除正常组外，其余各组继续高糖、高脂饮食至实验结束。将造模成功的32只小鼠随机分为模型组、三黄益肾胶囊组、卡托普利组。前期研究结果表明高剂量三黄益肾胶囊治疗效果最好^[14]，因此，本研究选择高剂量三黄益肾胶囊。模型组给予相同剂量的生理盐水灌胃治疗，疗程8周。每周称量并记录小鼠体质量。给药前及给药后第8周收集24 h尿液，记录尿量。给药第8周时，对所有小鼠进行解剖，麻醉后处死小鼠留取样本。

1.3 肾脏组织学分析

提取肾脏并去除被膜，将左肾皮质切割后部分冻存于-80 ℃，用于相关蛋白表达检测。另一部分固定于4%多聚甲醛中，用于病理组织学及免疫组织化学法检测。剩余组织样本立即投入液氮，随后冻存于-80 ℃冰箱。右肾进行固定包埋后，制成厚度为4 μm的切片，经脱蜡、脱水处理后，进行苏木精-伊红（HE）与过碘酸雪夫（PAS）染色。最后，使用光学显微镜观察肾脏切片。

1.4 免疫荧光法

首先，对石蜡切片进行脱蜡处理，并进行抗原修复以暴露目标蛋白。圈定目标区域后，采用双氧水和血清分别处理切片，以阻断非特异性结合。随后，依次添加一抗和标记有辣根过氧化物酶（HRP）的二抗，利用微波加强抗体结合。之后，用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行复染，并采取措施淬灭自发荧光，最后进行封片。使用荧光显微镜对样本进行成像，并对荧光图像进行定量分析。随机选择10个视野，并使用ImageJ软件对荧光强度进行定量分析。

1.5 蛋白免疫印迹（Western blot）检测

准备放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液，其中RIPA和苯甲基磺酰氟（PMSF）的比例为100∶1，用于提取各组动物的蛋白质。将等量蛋白质加载至SurePage凝胶中进行电泳。将电泳分离的蛋白转移到微孔PVDF膜上，并使用相应的一抗进行免疫印迹操作。一抗反应完成后，使用免疫球蛋白（H+L）-HRP偶联的二抗。采用增强型电化学发光（ECL）检测系统进行免疫印迹检测。在分析过程中，使用GAPDH作为内部参照物进行蛋白质水平均一化处理。

1.6 统计学分析

使用SPSS 26.0进行数据的统计学分析。对于符合正态分布的计量资料，采用均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用配对t检验，3组间的比较采用单因素方差分析，在发现整体差异有统计学意义后，使用LSD法进行两两比较。当P < 0.05时认为差异存在统计学意义。

2 结果 2.1 三黄益肾胶囊对DKD小鼠体质量和血糖的影响

与正常组比较，模型组小鼠体质量增加（P < 0.05）；药物治疗8周后，与模型组比较，三黄益肾胶囊组、卡托普利组小鼠体质量下降（P < 0.05或P < 0.01）。与正常组比较，模型组小鼠空腹血糖升高（P < 0.05）；药物治疗8周后，与模型组比较，三黄益肾胶囊组、卡托普利组小鼠空腹血糖降低（P < 0.05或P < 0.01）。见图 1。

2.2 三黄益肾胶囊对DKD小鼠肾功能的影响

与正常组比较，模型组小鼠24 h尿蛋白升高（P < 0.05）；药物治疗8周后，与模型组比较，三黄益肾胶囊组、卡托普利组小鼠24 h尿蛋白降低（P < 0.01）。与正常组比较，模型组小鼠血肌酐升高（P < 0.01）；与模型组比较，三黄益肾胶囊组、卡托普利组小鼠血肌酐降低（P < 0.01）。小鼠血尿素氮在各组之间未见显著变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见图 2。

2.3 三黄益肾胶囊对DKD小鼠血脂水平的影响

与正常组比较，模型组小鼠总胆固醇水平升高（P < 0.05）；与模型组比较，三黄益肾胶囊组、卡托普利组小鼠总胆固醇水平下降（P < 0.05）。三酰甘油水平虽有上升但差异无统计学意义，药物治疗后也无明显变化（P>0.05）。与正常组比较，模型组小鼠低密度脂蛋白水平升高（P < 0.05）；与模型组比较，三黄益肾胶囊组小鼠低密度脂蛋白水平降低（P < 0.05），卡托普利组差异无统计学意义（P>0.05）。见图 3。

2.4 三黄益肾胶囊对DKD小鼠肾脏的影响及其形态学变化

通过HE和PAS染色观察，发现与正常组比较，模型组小鼠的肾脏组织出现肾小管上皮细胞水肿、肥大、肾小管空泡病变、萎缩和形状不规则，上皮细胞脱落，以及间质炎症。此外，肾小球结构出现水肿，小球空间缩窄，细胞排列紊乱等异常状态。使用三黄益肾胶囊和卡托普利治疗8周后，观察到上皮细胞水肿、肾小管空泡和萎缩症状明显改善，同时上皮细胞脱落、肾小管扩张和间质炎症程度显著减少，肾小管形态更为规则，肾小球水肿减轻，细胞排列更加整齐，整体病理状态得到改善，其中三黄益肾胶囊组小鼠更为明显。见图 4。

2.5 三黄益肾胶囊对DKD小鼠肾脏细胞焦亡的影响

与正常组比较，模型组小鼠肾组织凋亡表达明显增加（P < 0.01），荧光染色结果可见较多的Caspase-1阳性细胞（红色荧光）；与模型组比较，三黄益肾胶囊组、卡托普利组Caspase-1的阳性表达降低（P < 0.05或P < 0.01）。通过imageJ对荧光图像进行定量分析，发现模型组Caspase-1/DAPI值接近40%，高于正常组表达，而相比于模型组，经过三黄益肾胶囊、卡托普利干预后Caspase-1/DAPI值分别降低到了26%和21%。见图 5。

同时，为进一步分析三黄益肾胶囊对肾脏细胞焦亡的影响，对肾脏组织进行了Western blot检测，结果显示：与正常组比较，模型组Synaptopodin蛋白表达减少（P < 0.05），Caspase-1蛋白表达升高（P < 0.05）；与模型组比较，三黄益肾胶囊组、卡托普利组Synaptopodin蛋白表达升高（P < 0.05或P < 0.01），Caspase-1表达降低（P < 0.01）。见图 6。

3 讨论

DKD作为糖尿病极为严重的并发症之一，其全球发病率迅速增长。预计至2045年，将有6.93亿成年人可能受其影响。DKD患者面临病死率上升、视力丧失、肾功能衰竭和生活质量下降等严重风险^[15]。有效预防措施至关重要，可以有效延缓DKD病程进展。目前，西医在DKD的防治方面手段相对匮乏，主要集中在优化血糖控制、控制血压升高和血脂异常，以及常规使用肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）阻断剂^[16]。因此，临床上亟需找到安全有效的DKD治疗药物。近年来，随着社会对中医治疗效益的逐渐认可，针对各个医疗领域中医药的研究逐步增多^[17]。DKD在中医可以归于“肾消”“肾劳”“水肿”“胀满”“尿浊”等病证范畴^[18-19]。其病因病机学说多种多样，具体包括脾肾亏虚说、肾络瘀阻说、气阴两虚说等^[20]。中医认为DKD病机为素体肾虚，糖尿病迁延日久或失治误治，导致机体伤阴耗气，进一步阴损及阳，气血亏虚，同时兼夹“痰、热、瘀”等^[21]。故在治疗DKD的过程中，选方关键在于益气养阴、活血化瘀^[22-23]。中医药在治疗肾脏疾病方面历史悠久^[24]，临床疗效显著，且毒性低、毒副作用小，相比西医具有更多优势，深受青睐^[25-27]。

三黄益肾胶囊为河北省沧州中西医结合医院院内制剂，由黄芪、西洋参、山药、枸杞子、山茱萸、黄精、生地黄、芡实、金樱子、益母草、当归等组成^[28]。方以黄芪、黄精、生地黄为君，补脾益气、滋养肾阴；西洋参、枸杞子、山茱萸、山药为臣，益气养阴，滋养肝肾之阴；芡实、金樱子为佐，取水陆二仙丹之义，涩精消浊；益母草、当归为佐，以活血化瘀利水。全方共奏益气养阴、健脾补肾、活血化瘀之功^[29]。大量临床研究结果指出，三黄益肾胶囊对早期DKD患者的24 h微量白蛋白尿排泄量具有显著减少作用，并能推迟疾病进展^[30]。显示出其疗效显著，因此在临床实践中具有重要的应用潜力。

细胞焦亡又称为细胞炎性坏死，其特点是炎性因子大量表达，如白细胞介素（IL）-1β、IL-18和Caspase-1。Caspase-1的活化能够改变底物蛋白的活性，进而引发细胞凋亡的形态学特征并最终导致细胞解体^[31]。足细胞焦亡会导致足细胞逐渐丧失，细胞骨架紊乱，进而对肾小球滤过屏障造成不可逆损害，这与蛋白尿和肾小球硬化的发生密切相关^[32]。足细胞损伤与其骨架蛋白密切相关。Synaptopodin是足细胞的关键骨架调节蛋白和特异性标志物，其表达异常低下通常提示足细胞结构和功能变化，导致足细胞损伤^[33]。本实验使用三黄益肾胶囊对DKD小鼠进行干预，发现三黄益肾胶囊可以有效降低DKD小鼠尿蛋白，改善血糖及血肌酐指标，说明三黄益肾胶囊对于DKD具有一定治疗作用。同时，通过免疫荧光法检测细胞焦亡炎性因子Caspase-1在DKD小鼠肾脏组织中的表达，发现模型组小鼠Caspase-1的表达明显高于正常组小鼠，给予三黄益肾胶囊治疗后Caspase-1的表达降低，提示三黄益肾胶囊可以有效抑制肾脏细胞，尤其是肾小球足细胞焦亡的发生，避免足细胞功能丧失和死亡。同时Western blot法检测发现DKD小鼠肾脏组织中Synaptopodin蛋白表达低于正常组小鼠，Caspase-1的蛋白表达高于正常组；给予三黄益肾胶囊治疗后Synaptopodin蛋白表达升高，说明有效逆转了高糖环境以及代谢紊乱情况下的足细胞损伤；Caspase-1的蛋白表达降低，与免疫荧光结果一致，再次印证了三黄益肾胶囊对于肾脏细胞焦亡的抑制作用。这些实验说明三黄益肾胶囊抑制肾小球足细胞焦亡的发生可能是其改善DKD小鼠尿蛋白以及相关生化指标的重要机制。但是三黄益肾胶囊在DKD中发挥治疗作用的具体机制仍未探明，将在下一步实验中进一步研究探讨三黄益肾胶囊发挥作用的具体靶点以及潜在机制。

综上所述，三黄益肾胶囊能够降低DKD小鼠的尿蛋白、肌酐和血尿素氮水平，减少DKD导致的肾功能损伤。此外，它还可以降低血脂水平，减少肾脏细胞焦亡，缓解肾小管萎缩和细胞炎症反应，从而有效改善肾功能并延缓DKD的发展。这一发现可能揭示了三黄益肾胶囊在治疗DKD中的潜在机制，并为其在中医药临床应用提供了科学依据。