莲房（Nelumbinis Receptaculum）是睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥花托，最早记录可见于《食疗本草》^[1]，主要产自湖南、湖北、福建、江西等省份。其具有化瘀止血的功效，临床上多用于治疗崩漏，尿血，痔疮出血，产后瘀阻等妇科疾病^[2]。莲房中含有多种类型的化学成分，如黄酮类、生物碱类、多糖类、萜类、甾体类等^[3-4]。现代药理研究发现莲房具有显著的抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节、改善记忆认知等活性^[5-6]。目前，2020年版《中国药典》对莲房质量评价主要集中在药材的性状鉴别和显微鉴别上，尚未收录含量测定方面的内容，说明莲房药材质量控制仍不完善，这阻碍了莲房药材资源的进一步开发和利用。指纹图谱技术作为现代中药领域内一种较为成熟的中药质量控制方法，具有整体性高、特征性强等优势，已被广泛应用^[7]，但对莲房指纹特征图谱的研究较少。目前，基于指纹图谱结合多成分含量测定及化学计量学分析已经成为中药材质量综合评价的一种发展趋势，可用于建立全面合理的中药材质量评价方法，促进中药的规范化应用及开发^[8-10]。

本研究采用高效液相色谱（HPLC）建立了16批来自不同产地的莲房的指纹图谱，同时测定了莲房中6个成分的含量。结合指纹图谱相似度评价和化学计量学分析筛选出影响莲房质量的主要成分，以期为莲房质量控制指标选择和质量评价提供参考，也为莲房药材资源的选购和进一步开发提供依据。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），液相系统包括四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器；高速多功能粉碎机（武义海纳电器有限公司）；5427R台式高速离心机（德国Eppendorf公司）；MSA225P-0CE-DU型电子天平（德国Sartorius公司）；Milli-Q academic超纯水系统（美国Millipore公司）；超声波清洗机（小美超声仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品金丝桃苷、异槲皮苷、山柰酚-3-O-半乳糖苷、异鼠李素3-O-半乳糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素均购自成都曼斯特生物科技有限公司。所有标准品纯度均大于98%。乙腈（康科德），甲醇（康科德），甲酸（美国ACS恩科化学）均为色谱纯。超纯水由Milli-Q academic超纯水机制备。

1.3 药材

莲房药材购自国内多个省份，经天津中医药大学常艳旭教授鉴定为睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥花托，样品经粉碎机粉碎后，过60目筛，备用。具体信息见表 1。

2 方法与结果 2.1 溶液制备 2.1.1 供试品溶液的制备

精密称取莲房粉末1.00 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇30 mL，密塞，称定质量，在超声功率400 W条件下超声提取30 min，静置放冷，补足质量。所得溶液经14 000 r/min离心10 min后，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.1.2 对照品溶液的制备

分别精密称取对照品金丝桃苷、异槲皮苷、山柰酚-3-O-半乳糖苷、异鼠李素3-O-半乳糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素对照品适量，用甲醇溶解配制浓度均为1.0 mg/mL的标准品贮备液，分别吸取各储备溶液适量配制成含金丝桃苷100 μg/mL、异槲皮苷200 μg/mL、山柰酚-3-O-半乳糖苷40 μg/mL、异鼠李素3-O-半乳糖苷50 μg/mL、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷50 μg/mL、槲皮素10 μg/mL的混合标准品溶液，置于4 ℃冰箱内备用。

2.2 建立指纹图谱 2.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.2%（v/v）甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脱程序：0~10 min，10%~17% B；10~30 min，17% B；30~60 min，17%~42% B；流速：0.6 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长为360 nm；进样量10 μL。

2.2.2 精密度考察

取莲房药材粉末（编号为S13）按照“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，然后按照“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。以异槲皮苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间与峰面积的RSD。结果表明，各共有峰相对保留时间RSD < 0.21%，相对峰面积RSD < 1.9%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性考察

取莲房药材粉末（编号为S13），按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样，记录色谱图。以异槲皮苷为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果共有峰相对保留时间RSD < 0.14%、相对峰面积RSD < 2.1%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.4 重复性考察

取同一批莲房粉末（编号为S13），按“2.1.1”项下的供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，分别进样测定6份样品指纹图谱，以异槲皮苷为参照峰，计算得到各共有峰与参照峰的相对保留时间RSD < 0.32%，相对峰面积RSD < 2.5%，表明该方法重复性良好。

2.2.5 统计分析方法

获得的S1~S16批药材指纹图谱数据导入SCIMA 13.0软件中，使用聚类分析、主成分分析（PCA）与正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）对结果进行统计分析。

2.2.6 莲房指纹图谱的建立及其分析

将收集的S1~S16批次莲房，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱方法进样检测。将所得16批莲房药材色谱图数据依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版，以样品S13图谱为参照指纹图谱，中位数为基准，设置时间宽度为0.1，采用多点校正后进行全谱峰匹配，16批莲房药材指纹图谱共标识出8个共有指纹峰，并生成莲房药材对照指纹图谱，16批莲房药材的共有模式（R）及HPLC指纹图谱见图 1。

相似度评价作为中药指纹图谱的重要评价手段，可反映多个样本间化学成分差异及离散程度。通过相似度分析得出16批样品与对照指纹图谱的相似度介于0.984~0.999，见表 2。其中编号S3、S4、S9~S11共5批莲房指纹图谱的相似度较接近，其相似度值在0.984~0.990之间，其余11批莲房药材指纹图谱相似度在0.995~0.999之间，说明河北、山东两个产区的莲房相似度较一致，而福建、湖南、江西、湖北产地的莲房相似度较高。表明不同产地的莲房药材质量存在一定差异。另外16批莲房样品中共标定了8个共有峰，通过与对照品色谱图及保留时间比对指认出6个色谱峰，分别为2号峰金丝桃苷、3号峰异槲皮苷、4号峰山柰酚-3-O-半乳糖苷、5号峰异鼠李素3-O-半乳糖苷、6号峰异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、8号峰槲皮素。1号峰和7号峰为待指认峰。

2.3 化学计量学分析 2.3.1 聚类分析

以16批莲房样品的共有峰的峰面积为变量，应用SPSS 27.01软件进行聚类分析，以平方欧式距离为区间，采用组间联接进行聚类，结果见图 2。当分类距离为10~25时，16批莲房可以被分为2类，其中Ⅰ类包括S1、S2、S5~S8、S12~S16，Ⅱ类包括S3、S4、S9~S11。聚类分析的结果与相似度评价结果相一致，说明不同产地的莲房化学成分存在一定的差异。

2.3.2 主成分分析

为了更好地客观反映不同产地莲房之间的差异性，将16批莲房样品的共有峰的峰面积结果导入SIMCA 14.1软件，进行主成分分析（PCA）。通过主成分分析参数可知，累计解释能力参数R²X为0.972，预测能力参数Q²为0.897，说明该模型预测性良好。以主成分1和主成分2建立坐标系进行投影，得到16批莲房药材的PCA得分图，见图 3。结果显示，16批莲房药材基本可以分为两类，其中编号为S3、S4、S9~S11的样品归为一类，编号S1、S2、S5~S8、S12~S16的样品归为第二类，这与聚类分析的结果基本一致，可见不同产地的莲房之间存在一定差异。

2.3.3 正交偏最小二乘法判别分析

正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）是一种监督模式下的化学计量学方法，可用于寻找引起样品间差异的变量。因此，在PCA的基础上，进一步分析不同来源莲房样品之间的差异。采用SIMCA软件，以8个共有峰的峰面积为变量对16批莲房药材指纹图谱进行OPLS-DA分析。从模型验证的参数可知，所建立的模型解释能力和预测能力都较高，（R²X=0.982，R²Y=0.989，Q²=0.978），三个参数值均接近于1，表明该模型的拟合准确性好，具有较强的解释和预测能力。16批莲房药材基本可以分为两类，具体见图 4，分类结果与主成分分析结果一致。

将模型随机排列200次做置换检验，结果见图 5。由结果可知，R²和Q²截距值分别为0.35和-1.02，说明建立的OPLS-DA模型不存在过拟合现象，准确可靠。

在置信区间内，根据OPLS-DA模型中得到变量重要性投影（variable importance in projection，VIP），如图 6所示，通过设置VIP值大于1筛选出导致莲房差异的标志性成分，分别为峰3（异槲皮苷） > 峰2（金丝桃苷） > 峰5（异鼠李素3-O-半乳糖苷），以上成分可能是导致莲房质量产生差异的关键因素，可为今后莲房成分含量测定提供依据。

2.4 多成分含量测定 2.4.1 专属性考察

取莲房药材（编号：S13）粉末，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，取“2.1.2”项下混合对照品溶液以及空白溶剂，按“2.2.1”项下色谱条件进行分析。结果见图 7。供试品与对照品色谱图在相应的保留时间处有相同的色谱峰，空白溶剂无干扰，表明该定量分析方法专属性良好。

2.4.2 线性关系考察

精密移取“2.1.2”项下混合标准品储备液，依照倍比稀释法用甲醇稀释成8个不同浓度的混合标准品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。记录各浓度下的峰面积，以质量浓度为横坐标（x），仪器测得的峰面积为纵坐标（y），进行线性回归计算，并绘制标准曲线。同时以信噪比S/N为3：1作为其检测限（LOD），S/N为10：1作为其定量限（LOQ）。6个化合物的标准曲线、LOD与LOQ结果见表 3。从表 3中得知，6个化合物在线性范围内相关系数r²≥0.999 5，表明6个化合物在各自的线性范围内线性关系良好。

2.4.3 精密度考察

取“2.1.2”项下混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件下连续进样6次，计算6种成分的峰面积RSD值。结果见表 4。6种成分的峰面积RSD＜0.96%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性考察

取莲房药材（编号：S13）粉末，按“2.1.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，计算6种成分的峰面积的RSD值。结果见表 4。6种成分的峰面积RSD < 2.4%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 稳定性考察

取莲房药材（编号：S13）粉末，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样，计算6种成分的峰面积的RSD值，结果见表 4。6种成分的峰面积RSD < 2.2%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.6 加样回收率

精密称取同一批次已知含量的莲房粉末，并分别精密加入与样品中含量1∶1比例的对照品，此操作平行6份，按照“2.1.1”项下方法制备供试品溶液并按照“2.2.1”项下色谱条件测定各化合物峰面积，通过公式（测得量-原有量）/加标量×100%，计算各成分的平均回收率与RSD。各成分的平均回收率为99.7%、101%、103%、99.6%、98.7%、98.8%，RSD值分别为2.2%、2.5%、1.5%、1.2%、1.6%、2.2%，表明该检测方法符合要求。

2.4.7 莲房中6种化学成分含量测定

取16批莲房药材粉末，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，每批平行3份，并采用“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱峰面积，采用外标法计算样品中金丝桃苷、异槲皮苷、山柰酚-3-O-半乳糖苷、异鼠李素3-O-半乳糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素的含量。结果见表 5。其中16批药材中的金丝桃苷含量分布在0.062%~0.933%，异槲皮苷含量在0.233%~1.683%范围内，山柰酚-3-O-半乳糖苷含量分布在0.041%~0.155%，异鼠李素3-O-半乳糖苷的含量在0.055%~0.354%范围内，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量分布在0.052%~0.232%、槲皮素含量分布在0.011%~0.039%。同时含量测定结果表明，同一产地来源的莲房药材（S5~S8）成分含量具有差异，这可能由许多因素导致，例如不可控的环境因素、收获时间和栽培方法。这些种植环境和人为因素显著影响了药材的质量，值得进一步深入研究。同时来自河北和山东的S3、S4、S9、S10、S11批次药材的成分整体含量明显低于其他产地，这表明不同产地的莲房药材质量存在较大差异。

3 讨论 3.1 提取条件优化

本研究考察了提取时间（10、20、30、40 min）甲醇浓度（40%、60%、80%、100%）、料液比（g/mL）（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）对提取结果的影响。最终确定最佳提取条件为1.00 g莲房粉末，30 mL 80%甲醇溶解，超声提取30 min。

3.2 色谱条件优化

考虑到莲房中成分较多且类型复杂，因此对莲房样品使用HPLC-PDA在210~400 nm波长范围内进行全波长扫描，结果发现在360 nm时色谱峰较多且各色谱峰分离度较好，故选择360 nm作为检测波长。同时对色谱条件进行了优化，考察了不同流动相组成：水-乙腈、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇和0.2%甲酸水-乙腈对色谱峰的影响。发现在水溶液中甲酸后加入色谱图基线较平稳，且0.2%甲酸水-乙腈系统峰形较好。因此选择了0.2%甲酸水-乙腈为流动相。此外，由于样品中所含黄酮苷类成分极性相近，考察了流动相流速对色谱峰分离效果的影响。当流速为1.0 mL/min时，金丝桃苷与异槲皮苷色谱峰分离度较差。当流速为0.6 mL/min时，色谱峰分离度较优，故流动相流速选择0.6 mL/min。

3.3 莲房指纹图谱建立及化学计量学分析

本研究建立了16批不同产地莲房的指纹图谱，采用指纹图谱软件标定出8个共有峰，并采用对照品指认了6个成分。指纹图谱相似性评价表明不同产地的莲房药材具有一定差异。然而，《中国药典》2020年版中尚未收录莲房含量测定方面的内容。有研究通过测定金丝桃苷含量对莲房进行质量评价，但仅通过测定单一指标成分并不能全面反映药材质量^[11]。因此本研究通过化学计量学分析，探究影响莲房质量的标志性成分，并在同一色谱条件下对3种差异性成分和其余3种黄酮类成分进行定量分析，能够较为全面地对莲房的质量进行评价。由聚类分析和主成分分析结果可知不同产区的样品既有相似性，又具有一定的差异性。通过OPLS-DA以VIP值> 1为筛选标准得到不同产地的莲房药材主要差异性成分，异槲皮苷、金丝桃苷、异鼠李素3-O-半乳糖，它们均为黄酮类化合物，具有良好的抗血栓^[12]、抗氧化^[13]、抗炎^[14-15]、调节血小板功能作用^[16]。含量测定结果表明福建、湖南、江西、湖北产地的莲房中异槲皮苷含量在0.911~1.683 mg/g范围内，金丝桃苷含量介于0.453~0.933 mg/g，异鼠李素3-O-半乳糖苷含量在0.096~0.33 mg/g范围内；而河北、山东产地的莲房中异槲皮苷、金丝桃苷、异鼠李素3-O-半乳糖苷含量分别介于0.233~0.747、0.062~0.335、0.050~0.097 mg/g。筛选的3种标志物药理活性与药材功能主治和活性基本一致，同时含量测定结果表明不同产地药材中3种化合物的含量具有较大差异，这表明以其含量或总含量为质量评价指标具有合理性。

3.4 不足与展望

本研究建立的HPLC指纹图谱及含量测定方法为莲房药材质量控制提供了有效手段，但仍存在一定局限性。首先，样本量和产地覆盖范围相对有限，未能完全反映莲房自然生长环境，未来可纳入更多产地、不同生长年限或采收期的样品进行更全面的分析。其次，虽然指认了6种成分并筛选出3个关键标志物，但莲房可能含有其他具有重要生物活性的未知成分未被纳入评价体系，后续可结合高分辨质谱等技术进行更深入的成分鉴定与挖掘。

此外，筛选出的关键成分（异槲皮苷、金丝桃苷、异鼠李素-3-O-半乳糖苷）与莲房药效活性的具体关联性尚需通过药效学实验进一步验证。

4 结论

本研究建立了莲房的HPLC指纹图谱，对包括金丝桃苷、异槲皮苷在内的6种指标成分进行含量测定，应用化学计量学分析对不同产地莲房质量进行评价。所建立的方法重复性好，稳定、可靠，可为莲房的质量评价提供参考依据。