2025, Vol. 44文章信息
- 苏琳琳, 梁冰, 许海英, 郭莉琛, 曹玉爽, 杜鑫苑, 张彤, 袁庆, 胡利民
- SU Linlin, LIANG Bing, XU Haiying, GUO Lichen, CAO Yushuang, DU Xinyuan, ZHANG Tong, YUAN Qing, HU Limin
- 石菖蒲-川芎配伍通过调节Nrf2/HO-1通路改善阿尔茨海默病的作用机制研究
- Mechanisms of calamus chinensis-chuanxiong ameliorating Alzheimer's disease by regulating the Nrf2/HO-1 pathway
- 天津中医药大学学报, 2025, 44(8): 715-721
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2025, 44(8): 715-721
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2025.08.07
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文章历史
收稿日期: 2025-03-11
2. 天津中医药大学, 组分中药国家重点实验室, 天津 301617;
3. 天津市中药药理学重点实验室, 天津 301617
2. State Key Laboratory of Component Chinese Medicines, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China;
3. Key Laboratory of Pharmacology of Chinese Medicines, Tianjin 301617, China
阿尔茨海默病（AD）是一种慢性且不可逆的神经退行性疾病，临床表现为认知功能障碍、精神行为异常等。AD是最常见的神经退行性疾病，据估计，全球约有4 400万人患有痴呆，由于人口老龄化，到2050年，这一数字可能会增加两倍[1]。随着AD患者数量的增加，给家庭和社会带来了极大的痛苦和沉重的经济负担。尽管大量研究致力于阐明AD病理学，但其主要发病机制尚不完全清楚。AD患者的大脑特征包括细胞外β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块，细胞内磷酸化微管相关tau蛋白（p-tau）缠结、神经元丢失以及氧化应激等引起的进行性认知功能退化和记忆丧失等[2]。氧化应激是连接AD不同机制假说的桥梁，在AD的发病过程中起着至关重要的作用，是其发病机制中的核心因素[3]。
目前，美国食品药物管理局（FDA）已经批准了7种治疗AD的药物，但依旧无法有效治愈AD[4]。AD作为一种由多因素引起的异质性疾病，单靶点药物对于AD治疗药效作用有限。传统中医药具有多靶点、多环节整合调节的特点，越来越多的研究表明中医药在治疗痴呆症方面具有潜力。中医将阿尔茨海默病的基本病机归结为：脑髓失养、脾肾虚弱、瘀血阻滞、痰浊阻滞[5]。AD病位在脑，责之于先天不足或年老体衰，脏腑功能虚损，气血阴阳化生不足，致使瘀血、痰浊、毒邪化生，阻滞脑窍。张伯礼院士基于其丰富的临床经验指出，AD的核心病机在于肾精亏虚及脏腑功能亏损，引起痰浊血瘀相互交织，损及脑络。治疗应以补虚为主，同时兼顾泻实，痰瘀并举[6]。
研究发现，在中医临床治疗痴呆中，基于开窍化瘀，石菖蒲和川芎在治疗阿尔茨海默病的复方中用药频次最高，分别为47.05%和41.17%[7-9]。
Aβ是由淀粉样前体蛋白（APP）经过β-和γ-分泌酶水解产生的，含有39~43个氨基酸的多肽。过度产生的Aβ可形成不溶性低聚物和原纤维，激活神经毒性级联反应，最终导致神经元功能障碍和细胞死亡[10]。研究表明，血浆中Aβ1-40与AD密切相关，可能作为AD的重要临床预测因子[11]。因此，可通过检测Aβ1-40判断AD的预后情况。
核因子-红细胞2相关因子2（Nrf2）是细胞内调节抗氧化基因表达的重要分子，可调控下游血红素氧化酶1（HO-1）因子的转录。Nrf2/HO-1可以通过调节脑组织的抗氧化水平改善脑部的认知受损功能[12]。目前石菖蒲-川芎能否通过调控Nrf2/HO-1信号通路改善AD认知功能障碍尚不清楚。因此，本研究基于AD血瘀痰浊的病机以及石菖蒲-川芎开窍豁痰、活血行气之作用等中医理论，通过建立D-半乳糖联合亚硝酸钠（D-Galactose—Sodium nitrite，D-gal—NaNO2）诱导的AD模型小鼠，探讨石菖蒲-川芎配伍能否通过调控Nrf2/HO-1通路改善AD诱发的氧化应激反应和认知功能障碍的作用，以期为AD的临床治疗提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 药品与试剂中药石菖蒲、川芎（SCP、CX）均购于北京同仁堂有限公司，经天津中医药大学中药鉴定学专家李天祥教授鉴定为正品；盐酸多奈哌齐（Donepezil）购自卫材（中国）药业有限公司（国药准字H20050978）；D-半乳糖（D-gal，批号：G0750）购于美国Sigma公司；亚硝酸钠（Sodium nitrite NaNO2，批号：S111976）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；β-actin抗体（批号：4970S）购于美国CST生物公司；HO-1抗体（批号：abs131494）购于爱必信（上海）生物科技公司；Nrf2抗体（批号：A21176）购于中国爱博泰克生物（AB clonal）有限公司；ELISA试剂盒Aβ1-40（批号：CBS-E08300m）购于武汉华美生物工程有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（WST-1法）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（TBA法）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号：A001-3、A003-1、A005-1）；活性氧（ROS）ELISA试剂盒（货号：SBJ-M0608）购于中国森贝伽生物科技有限公司。
1.2 仪器Morris水迷宫（安徽正华生物仪器有限公司）；1658001型Western-blot电泳仪（美国Bio-Rad公司）；trans-blot型转膜仪（美国Invitrogen公司）；WZ80-2型微孔板恒温振荡器（杭州佑宁仪器有限公司）；Eclipse Ti型倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）；FlexStation3型多功能酶标仪（美国MD公司）。
1.3 方法 1.3.1 实验动物SPF级雄性C57BL/6小鼠60只，8周龄，由北京维通利华实验动物公司提供，许可证号：SCXK（京）2021-0006。本实验经天津中医药大学实验动物伦理委员会批准（TCM-LAEC2022242）。实验期间动物均饲养于天津中医药大学实验动物中心，自由进食进水，饲养环境12 h明暗交替，室温20~25 ℃，相对湿度56%~60%，实验过程严格遵循天津中医药大学动物中心相关法则。
1.3.2 药物制备SCP、CX水提液制备：分别称取200 g SCP、CX饮片，碾碎后置于圆底烧瓶，加入1 000 mL超纯水及3颗防沸珠，安装挥发油收集管和冷凝器。加热至沸腾后调低温度煎煮3 h，过滤药液，再加入1 000 mL超纯水二次煎煮，直到挥发油收集管不再增加挥发油。收集挥发油并放入4 ℃冰箱保存。烧瓶中的水提液静置15 min后用纱布过滤，合并两次药液放入旋转蒸发仪进行浓缩。最后，将蒸发得到的挥发油与浓缩药液混合，使得最终SCP、CX的药液浓度达到1 g/mL。
通过查阅经典方剂以及临床经验方中的石菖蒲、川芎药对临床上使用的药量以及配比确定本实验中石菖蒲、川芎的用量和比例。通过文献搜集发现，石菖蒲用药量大多在10~15 g，川芎用药量大多在3~8 g[13-15]。因此本实验采用SCP、CX用量为12 g、6 g（临床成年人用量），换算成小鼠剂量为1.6、0.8 g/kg。
Donepezil：取一片药片（5 mg）溶解于50 mL的纯水中，可得0.1 mg/mL的盐酸多奈哌齐药液；D-gal与NaNO2：称取0.9 g D-gal和0.034 g NaNO2溶解于50 mL的生理盐水中，4 ℃保存备用；
1.3.3 动物分组及给药随机将60只C57BL/6小鼠分为6组：Control组、Model组、给药组[SCP、CX、SCP-CX和盐酸多奈哌齐（Donepezil）组]，每组10只。除Control组外，其余各组均每天皮下注射120 mg/kg D-gal和45 mg/kg NaNO2溶液造模，Control组每天给予等量生理盐水，连续12周。
造模第4周后各给药组开始灌胃给药：Donepezil组（0.65 mg/kg）、SCP组（1.6 mg/kg）、CX组（0.8 mg/kg）、SCP-CX组（1.6 mg/kg与0.8 mg/kg），Control组和Model组用等体积的纯水代替，每日1次，连续灌胃8周。
1.3.4 Morris水迷宫测试造模前后均采用Morris水迷宫进行小鼠认知能力测试，剔除经训练后仍不能登上目标平台的小鼠。Morris水迷宫测试时，灌注足量的纯水约高出平台1.0~1.5 cm，水温约25 ℃，池中加入适量二氧化钛，充分混匀最终池水为乳白色，调试仪器识别小鼠入水至登上平台时间即为逃避潜伏期。若小鼠在60 s内未能找到并登上平台，实验人员将其轻柔引导至平台，并使其在平台上停留10 s以强化记忆。每隔24 h测量一次，连续训练5 d，第6天为测试期，撤去平台记录小鼠经过平台的次数。
1.3.5 试剂盒检测小鼠血清GSH-Px、MDA含量、SOD活性检测小鼠末次给药2 h后，摘眼球取血，用1.5 mL EP管收集眼球血液。血液室温静置30 min后，4 ℃，3 000 rpm，离心10 min（离心半径12 cm），收集上层血清，于-80 ℃冰箱保存。取各组小鼠血清参照GSH-Px、MAD、SOD检测试剂盒说明书进行检测，用酶标仪检测吸光度，计算各组样品GSH-Px、MAD、SOD水平。
1.3.6 ELISA检测小鼠海马脑组织ROS含量小鼠末次给药2 h后，异氟烷麻醉小鼠，心脏灌注至四肢发白。冰板上快速剥离皮层摘取小鼠海马组织，吸取水分，称重，冰上匀浆后4 ℃，3 000 rpm，离心20 min（离心半径12 cm），取上清用于ELISA检测各组ROS含量。
1.3.7 ELISA检测小鼠海马脑组织Aβ1-40含量异氟烷麻醉小鼠后，对小鼠进行心脏灌注，冰板剥离大脑皮质取出海马组织进行匀浆，4 ℃，5 000×g，离心5 min（离心半径12 cm），取上清按照ELISA试剂盒检测各组Aβ1-40含量。
1.3.8 Western Blotting检测小鼠脑组织Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达从-80 ℃取出小鼠脑组织，按照每100 mg组织加入100 μL蛋白酶抑制剂和1 mL RIPA裂解液。脑组织充分匀浆于4 ℃，15 000 r/min，离心15 min（离心半径12 cm），取上清进行BCA蛋白定量。定量后100 ℃金属浴10 min，冰上静置，恢复室温后放入-20 ℃冰箱保存用于后续Western Blotting实验。
1.3.9 统计学方法采用SPSS 25.0软件进行统计分析数据，统计结果以均数±标准差（x±s）表示。水迷宫数据用重复测量的多因素方差分析（multi-way ANOVA）进行比较，其余数据用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行组间比较，P＜0.05表示有统计学意义。
2 结果 2.1 石菖蒲-川芎对AD模型小鼠认知能力的影响如图 1、表 1所示，Morris水迷宫结果显示，与Control组比较，Model组小鼠逃避潜伏期显著增多（P＜0.05）；与Model组比较，SCP组、CX组、SCP-CX组、Donepezil组小鼠逃避潜伏期显著缩短（P＜0.05）。各组小鼠代表性水迷宫轨迹图如图 2所示。
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| 注：与Control组比较，*P＜0.05；与Model组比较，#P＜0.05。 图 1 各组AD小鼠Morris水迷宫实验训练期的逃避潜伏期（x±s，n=10） |
| 组别 | 动物数 | 逃避潜伏期（s） | 穿越平台数（次） |
| Control | 10 | 9.8±6.18 | 3.8±1.99 |
| Model | 10 | 27.6±11.77* | 1.1±1.10* |
| Donepezil | 10 | 8.3±5.96# | 3.7±1.34# |
| SCP | 10 | 7.0±2.11# | 3.9±1.66# |
| CX | 10 | 9.0±2.40# | 3.6±1.43# |
| SCP-CX | 10 | 8.8±3.52# | 3.8±1.62# |
| 注：与Control组比较，*P＜0.05；与Model组比较，#P＜0.05。 | |||
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| 图 2 各组AD小鼠Morris水迷宫代表轨迹图 |
如表 1所示，各组小鼠空间探索结果显示，与Control组比较，Model组第一次穿越平台的时间显著延长，穿越平台的次数显著减少（P＜0.05）；与Model组比较，SCP组、CX组、SCP-CX组、Donepezil组第一次穿越平台的时间显著缩短（P＜0.05）；与Model组比较，SCP组、SCP-CX组、Donepezil组穿越平台的次数显著增加（P＜0.05）。
结果表明，SCP-CX可以有效改善AD模型小鼠的空间记忆和学习能力。
2.2 石菖蒲-川芎对AD模型小鼠血清中氧化因子GSH-Px、MDA、SOD的影响如图 3所示，与Control组比较，Model组小鼠血清中的GSH-Px、SOD水平显著降低（P＜0.05）、MDA显著升高（P＜0.05）；与Model组比较，SCP组、CX组、SCP-CX组、Donepezil组GSH-Px水平、SOD活性显著上升（P＜0.05）；与Model组比较，CX组、SCP-CX组、Donepezil组MDA含量显著下降（P＜0.05），SCP组小鼠血清中MDA水平有下降趋势，但无显著性差异（P＞0.05）。
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| 注：与Control组比较，*P＜0.05；与Model组比较，#P＜0.05。 图 3 各组AD小鼠血清中GSH-Px、MDA和SOD水平表达情况（x±s，n=3） |
结果表明，SCP-CX提取液可以通过降低AD模型小鼠血清中MDA含量，提高SOD和GSH-Px水平的表达发挥抗氧化作用。
2.3 石菖蒲-川芎对AD模型小鼠脑组织ROS的影响如图 4所示，与Control组比较，Model组小鼠海马组织中ROS水平显著升高（P＜0.05）；与Model组比较，SCP组、CX组、SCP-CX组、Donepezil组小鼠海马组织中ROS水平显著降低（P＜0.05）。
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| 注：与Control组比较，*P＜0.05；与Model组比较，#P＜0.05。 图 4 各组AD小鼠脑组织中ROS水平表达情况（x±s，n=6） |
结果表明，SCP-CX可以有效降低AD模型小鼠脑组织ROS表达，从而发挥抗氧化应激作用。
2.4 石菖蒲-川芎对AD模型小鼠脑组织Aβ1-40含量的影响如图 5所示，与Control组比较，Model组小鼠海马区Aβ1-40含量显著升高（P＜0.05）；与Model组比较，SCP组、CCX组、SCP-CX组、Donepezil组Aβ1-40含量均显著下降（P＜0.05）。
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| 注：与Control组比较，*P＜0.05；与Model组比较，#P＜0.05。 图 5 各组AD小鼠海马组织Aβ1-40含量表达情况（x±s，n=4） |
结果表明，SCP-CX可以有效减少小鼠海马组织Aβ1-40沉积，改善AD模型小鼠海马组织病理状态。
2.5 石菖蒲-川芎对AD小鼠脑组织Nrf2/HO-1信号通路的影响如图 6所示，Western Blotting结果显示，与Control组比较，Model组Nrf2、HO-1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。与Model组相比，SCP-CX组Nrf2、HO-1蛋白水平显著升高（P＜0.05）；且与SCP组比较，SCP-CX组Nrf2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。
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| 注：与Control组比较，*P＜0.05；与Model组比较，#P＜0.05；与SCP组比较，△P＜0.05。 图 6 各组AD小鼠大脑Nrf2/HO-1蛋白表达情况（x±s，n=4） |
结果表明，SCP-CX可以通过增加Nrf2、HO-1蛋白表达改善AD模型小鼠体内氧化应激作用。
3 讨论中医药在防治AD方面具有多靶点多环节整合调节的独特优势。多项研究表明，SCP-CX及其有效成分通过调节与痴呆相关的信号转导通路，改善痴呆症状并延缓其进展[8]。
研究发现，SCP可以有效提高抗氧化损伤能力，改善小鼠的空间记忆能力[16]。CX有效提取物可以激活Nrf2通路减少氧化损伤，从而延缓细胞衰老并改善神经功能和认知障碍[17]。基于SCP-CX配伍的豁痰开窍、行气活血之功效，本课题前期通过皮下注射D-gal—NaNO2建立AD小鼠模型对其药效作用进行探究，发现SCP能够增加AD模型小鼠脑血流量，调节Aβ代谢相关蛋白的表达，减少脑Aβ沉积[18]；SCP-CX能有效改善AD模型小鼠神经-血管功能[19]。因此，本课题继续选用D-gal—NaNO2建立AD模型小鼠，探究SCP-CX对D-gal—NaNO2诱导的小鼠空间记忆能力影响，并进一步探究其作用机制。
本研究通过D-gal-NaNO2诱导AD模型小鼠，探讨了SCP-CX配伍改善AD的作用及其机制。Morris水迷宫实验结果显示，与Model组相比，SCP-CX组小鼠的逃避潜伏期显著缩短，穿越平台次数显著增加，表明SCP-CX能有效改善AD模型小鼠的空间学习记忆能力。这与前期研究发现的SCP-CX能改善AD模型小鼠神经-血管功能的结果相一致。氧化应激相关指标检测结果显示，与Model组相比，SCP-CX组显著提高了血清中GSH-Px水平和SOD活性，降低了MDA含量。同时，SCP-CX组显著降低了海马组织中ROS水平。这些结果表明SCP-CX具有显著的抗氧化作用，可以减轻AD模型小鼠的氧化应激损伤。特别是作为氧化应激第一道防线的SOD，其活性的提高说明SCP-CX能增强机体抗氧化能力；此外，MDA含量的降低表明SCP-CX可减轻脂质过氧化损伤。ELISA检测结果显示，SCP-CX组小鼠海马组织中Aβ1-40的含量显著降低。研究表明，Aβ1-40沉积与AD密切相关，可作为临床AD的重要预测因子。SCP-CX降低Aβ1-40的作用提示其可能通过减少Aβ沉积来改善AD病理状态。Western Blotting结果显示，与Model组相比，SCP-CX组显著提高了Nrf2和HO-1蛋白的表达水平。值得注意的是，与SCP组相比，SCP-CX组的Nrf2蛋白表达水平显著升高，初步揭示了配伍用药可能存在协同作用。已有研究表明，激活Nrf2/HO-1通路可促进抗氧化基因表达，增强线粒体功能。实验结果表明，SCP-CX可通过激活Nrf2/HO-1通路发挥抗氧化作用，为其改善AD提供了分子机制依据。
综上所述，本研究通过多个实验结果证实，SCP-CX配伍可通过激活Nrf2/HO-1信号通路，发挥抗氧化作用，减少Aβ沉积，改善AD模型小鼠的认知功能。本研究不仅为SCP-CX配伍改善AD提供了实验依据，也从现代药理学角度阐释了中医“开窍豁痰，活血化瘀”的治疗理念。然而，考虑到AD发病机制的复杂性，SCP-CX配伍的具体作用机制及其配伍优势仍需要进一步探究。
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