2025, Vol. 44文章信息
- 黄成硕, 陈驹, 林颢, 梁振, 郑锦畅, 郭伟雄, 曾莉
- HUANG Chenshuo, CHEN Ju, LIN Hao, LIANG Zhen, ZHENG Jinchang, GUO Weixiong, ZENG Li
- 通过Wnt/β-catenin信号通路探究莪术二酮对小鼠骨关节炎的作用
- The effects of curdione on osteoarthritis in mice based on Wnt/β-catenin signaling pathway
- 天津中医药大学学报, 2025, 44(9): 793-797
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2025, 44(9): 793-797
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2025.09.05
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文章历史
收稿日期: 2025-03-20
引用本文 |
2. 广东医科大学附属医院药学部，湛江 524001;
3. 广东医科大学附属医院骨科中心，湛江 524001
2. Department of Pharmacy, Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524001, China;
3. Orthopaedic Center, Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524001, China
骨关节炎（OA）是一种以不可逆进展为特征的慢性全关节退行性疾病，是高发病率且全球患病率不断上升的与年龄相关的疾病，可导致关节僵硬、疼痛和残疾[1]。骨性关节炎的特征是关节软骨磨损、滑膜病变、囊挛缩、骨赘形成和软骨下骨髓病变[2-3]。目前，据估计全世界有2.5亿人患有症状性OA[4]。到2030年，这一数字将达到4亿[5]。在中国，大约10%的女性和6%的男性患有膝关节炎[6]。OA的治疗药物包括镇痛药和非甾体抗炎药，这只是提供疼痛缓解，但在预防或改善OA方面没有明确的临床效果。此外，多种治疗OA的药物策略目前已在研究，包括蛋白酶抑制剂、抗炎疗法、干细胞治疗和生物制剂治疗，但这些疗法的疗效和安全性仍然不明确[7]。在临床上，除了终末期手术关节置换术外，没有任何治疗策略可以挽救OA进展[8]。人们普遍认为OA是一种多因素导致的疾病，发病机制复杂，涉及炎症、氧化应激损伤和免疫等[9]。目前仍需要开发更好的靶向治疗药物。
莪术二酮是中药莪术的有效成分之一，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化应激以及抗凝等作用[10]。笔者前期预实验结果表明莪术二酮对骨关节炎具有较好的改善作用，但其作用机制不清。目前，莪术二酮对骨关节炎的作用也未见相关研究报道。本研究拟通过内侧半月板失稳术建立小鼠骨关节炎模型，探讨莪术二酮对骨关节炎的影响。
1 材料 1.1 动物SPF级雄性C57BL/6小鼠30只，8周龄，体质量18~22 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物合格证号：SCXK（辽）2021-0005。小鼠分笼饲养，每笼5只，光照/黑暗周期为12 h/12 h，室温为（22±1）℃，湿度为40%~60%，自由饮食。动物适应性培养1周后开展实验。实验过程符合广东医科大学动物实验伦理学标准，伦理批准号：GDMU-2023-000112。
1.2 仪器LD-96S全波长酶联免疫分析仪购于山东莱恩德智能科技有限公司；TJQ-3558半自动石蜡切片机购于新乡市红旗区天健教学设备有限公司；DYCZ24DN电泳仪购于北京六一生物科技有限公司。
1.3 药物与试剂莪术二酮：≥ 98%（上海捌加壹医药科技有限公司，批号：20230215）；番红O染液（北京诺博莱德科技有限公司，批号D8866）；苏木精-伊红染色（HE）（南京建成股份有限公司，批号D006-1-1）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）检测试剂盒（南京建成股份有限公司，批号分别为H052-1-2、H002-1-2、H007-1-2、H009-1-2、A001-3-2、A003-1-2和A005-1-2）；STING、wnt3a和β-catenin单抗（Cell Signaling Technology公司，批号分别为20231124和20220213）。
2 方法 2.1 分组与给药30只SPF级雄性C57BL/6小鼠采用随机数字表法进行分组，随机分为假手术组（Sham组）、模型组（OA组）和莪术二酮组（ESET组，60 mg/kg），每组10只。其中OA组和ESET组小鼠内侧半月板失稳术建立骨关节炎小鼠模型，而假手术组小鼠不切韧带，其余手术过程同模型组。造模成功后，ESET组小鼠灌胃给予莪术二酮，给药剂量为60 mg/kg，连续给药4周。Sham组和OA组小鼠灌胃给予生理盐水。
2.2 小鼠OA模型的建立所有实验操作均在SPF级环境中进行，参照文献[11]OA造模方法进行造模，具体步骤如下：5%异氟烷麻醉小鼠，将其置仰卧位，碘伏消毒液对右下肢膝关节皮肤进行消毒。手术刀将膝关节做一长约2 mm纵型切口，小心打开关节囊，向外侧挤压髌骨致髌骨外侧脱位，屈曲膝关节，充分显露内侧半月板与内侧半月板股骨韧带，眼科剪断半月板股骨韧带。然后逐层缝合关节囊以及皮肤，所有组别小鼠均术后局部注射庆大霉素防止感染。
2.3 取材灌胃4周后，5%异氟烷麻醉小鼠，摘眼球取血，常温静置30 min，3 500 r/min离心10 min，离心半径87 mm，分离血清，-20 ℃保存，每组选取6只小鼠，截取右侧膝关节样本，于10%中性甲醛浸泡保存。
2.4 膝关节形态学观察取10%多聚甲醛溶液固定好的小鼠右侧膝关节，将其置于0.5 mmol/L乙二胺四乙酸磷酸盐缓冲液（EDTA-PBS）（pH7.8）中常温脱钙，共14 d，生理盐水冲洗干净后，再分别于70%~100%梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片，厚度为5 μm，随后进行番红O染液和HE染色，显微镜下观察拍照。
2.5 血清炎症因子和氧化应激损伤指标水平检测根据试剂盒说明书检测步骤，分别检测各组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、MDA水平和SOD、GSH-PX活性。
2.6 免疫组化法观察膝关节Wnt/β-catenin通路关键蛋白表达水平膝关节石蜡切片置于60 ℃烤箱烤干后，常规梯度乙醇脱蜡以及复水，柠檬酸钠抗原修复液修复，一抗（wnt3a和β-catenin）4 ℃过夜，滴加二抗，DAB溶液显影。显微镜下观察拍照，图片经Image J软件分析量化。
2.7 蛋白免疫印迹（Western blot）检测Wnt/β-catenin通路关键蛋白表达水平液氮下将右侧膝关节研磨成粉末，提取总蛋白，样品进行SDS/PAGE凝胶电泳，随后电泳转移到PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后，膜在4 ℃下用wnt3a（1∶1 000）和β-catenin（1∶1 000）单克隆抗体孵育过夜。第2天，膜用相应的二抗孵育1 h。随后，超敏化学发光溶液孵育并曝光PVDF膜，利用Image J软件对条带进行半定量分析。
2.8 统计学方法计量资料用均数±标准差（x±s）表示。使用GraphPad Prism 7进行统计分析。通过SPSS 26.0软件中的单因素方差分析（ANOVA）评估各组之间的差异。P＜0.05为差异具有统计学意义。
3 结果 3.1 莪术二酮对骨关节炎小鼠膝关节病理学变化的影响与Sham组比较，OA组小鼠膝关节有大量炎症细胞浸润，软骨组织损伤严重。与OA组比较，ESET组小鼠上述症状有明显改善，见图 1。
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| 注：其中A和D为Sham组，B和E为OA组，C和F为ESET组；A-C为番红O染色，D-F为HE染色。 图 1 各组小鼠膝关节病理学变化（×10） |
与Sham组比较，OA组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平升高（P＜0.01）；与OA组比较，ESET组小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低（P＜0.01），而IL-10水平升高（P＜0.01），见图 2。
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| 注：与Sham组比较，**P＜0.01，与OA组比较，##P＜0.01。 图 2 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平（x±s，n=10） |
与Sham组比较，OA组小鼠血清SOD和GSH-PX活性降低，而MDA水平升高（P＜0.01）；与OA组比较，ESET组小鼠血清SOD和GSH-PX活性升高，而MDA水平降低（P＜0.01），见图 3。
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| 注：其中A为各组小鼠血清SOD水平，B为各组小鼠血清GSH-PX水平，B为各组小鼠血清MDA水平；与Sham组比较，**P＜0.01，与OA组比较，##P＜0.01。 图 3 各组小鼠血清SOD、GSH-PX和MDA水平（x±s，n=10） |
与Sham组比较，OA组小鼠膝关节wnt3a和β-catenin表达水平升高（P＜0.01）；与OA组比较，ESET组小鼠膝关节wnt3a和β-catenin表达水平降低（P＜0.01），见图 4。
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| 注：其中A-C为wnt3a免疫组化图，D-F为β-catenin免疫组化图，A和D为Sham组，B和E为OA组，C和F为ESET组，×20。与Sham组比较，**P＜0.01；与OA组比较，##P＜0.01。 图 4 各组小鼠膝关节wnt3a和β-catenin表达水平（x±s，n=10） |
与Sham组比较，OA组小鼠膝关节wnt3a和β-catenin蛋白相对表达水平升高（P＜0.01）；与OA组比较，ESET组小鼠膝关节wnt3a和β-catenin蛋白相对表达水平降低（P＜0.01），见图 5。
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| 注：与Sham组比较，**P＜0.01；与OA组比较，##P＜0.01。 图 5 各组小鼠膝关节wnt3a和β-catenin蛋白表达水平（x±s，n=10） |
骨性关节炎是临床上常见的退行性疾病，主要表现为关节软骨的破坏[12]。骨性关节炎目前主要通过药物或手术治疗，但尚未取得满意的疗效。OA是由合成代谢和分解代谢因子失衡引起的，与异常的机械应力密切相关[13]。依据OA造模的干预形式，OA动物模型可分为自发模型、诱发模型（手术型或非手术型）和转基因模型。目前并没有完美的OA动物模型，其中手术诱发的OA动物模型具有造模成功率高、相对术式简单、造模周期短的优势广泛用于骨关节炎相关的科学研究[14]。然而，需要注意的是手术诱发的OA动物模型是否可准确地模拟人类OA进展仍需进一步探讨。在实验中，笔者利用内侧半月板失稳术构建骨关节炎模型，结果显示OA组小鼠膝关节有大量炎症细胞浸润，软骨组织损伤严重，血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和MDA水平升高，而SOD和GSH-PX活性降低，提示OA小鼠模型构建成功。
莪术二酮是莪术重要药效组成之一，具有较高的研究价值。现代药理学研究表明其作用包括抗炎、抗氧化损伤、抗肿瘤、镇痛、保护心脑血管和抗血栓等[15]。目前仍然缺乏其抗OA的研究进展。本研究发现莪术二酮可明显改善OA的病理学损伤，如降低炎症细胞浸润和软骨组织损伤。氧化应激是活性氧产生与抗氧化防御系统清除之间不平衡的结果，在OA患者的软骨中，氧化应激水平显著升高，是慢性炎症的主要原因。炎症介质，如TNF-α、IL-1β和IL-6在OA关节中高度上调，诱导活性氧的产生和基质降解蛋白酶的表达，导致基质降解和关节功能障碍。氧化应激和炎症是相互依存的，互为对方的靶标，可见，两者均是OA治疗的理想靶标[9]。笔者发现莪术二酮显著降低OA小鼠模型的血清炎症因子和氧化应激损伤指标水平，提示莪术二酮抑制OA可能通过其抗炎抗氧化应激作用有关。
近期证据表明[16]，Wnt/β-catenin信号通路可能在调节OA和其他形式关节炎的发病机制中发挥重要作用。典型的Wnt通路通过调节细胞内β-catenin水平和β-catenin的亚细胞定位触发其在细胞内的信号传导，影响骨细胞形成和骨构建[16]。研究发现OA组小鼠膝关节wnt3a和β-catenin蛋白表达水平明显升高，莪术二酮显著降低膝关节wnt3a和β-catenin蛋白表达水平，提示莪术二酮可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路，影响骨代谢，从而改善OA。
综上所述，莪术二酮可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路减轻炎症和氧化应激损伤，从而改善骨关节炎。
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