毒性与人类的生活息息相关, 因此毒性研究在人类健康领域占据着重要地位。当前, 国内的毒性研究主要集中在四大领域: 中药、化学药物、农药以及环境毒理学。其中, 中药的毒性研究尤为引人注目, 这主要归因于中药毒性成分及机制的多样性和复杂性严重制约了其临床应用和国内外市场开发^[1]。化学药物的毒性研究则是药物发现与开发过程中不可或缺的科学环节^[2], 此外, 毒性研究领域深入探究了农药的使用过程中因不受控制传播和脱靶施用所引发的毒性效应^[3], 也研究了日常生活中的环境暴露毒性效应。这些毒性研究不仅与民众的福祉息息相关, 更是推动人类健康事业持续发展的关键因素。代谢组学作为一种系统生物学方法, 广泛应用于发现毒性诊断标志物及预测敏感性和预后, 它分析整体代谢物及在生物系统中的功能, 通过筛选差异代谢物, 可以获得有关组织的多样化信息, 这种特性与中医的整体观一致, 因此它是系统评价毒性、寻找潜在生物标志物和探究中药毒性机制的合适工具。然而, 代谢组学在测定代谢物的空间分布方面存在很大局限性, 这导致更深层次的内源性途径被掩盖, 因此该方法在解释结果时可能会产生偏差^[4], 无法从代谢异质性和空间分布角度阐述代谢物的生理机制^[5]。空间代谢组学是继代谢组学之后, 基于质谱成像技术(MSI)发展起来的1项高新技术, 其在应用场景和数据分析层面都与传统的代谢组学存在显著差异。传统代谢组学通过均质化处理样本获得整体代谢物谱, 完全缺失了空间分布特征, 且对低丰度代谢物(nM-μM级)的检测灵敏度有限^[5]。例如, 在补骨脂肝毒性的研究中, 虽然通过传统代谢组学技术筛选出了14种差异代谢物, 但却无法追溯其具体的微区来源^[6]。相比之下, 空间代谢组学直接在组织切片上实现代谢物原位检测, 分辨率可达10~50 μm, 单次可识别超过1 000种代谢物并精确定位其空间分布^[7]。例如, 空间代谢组学在马兜铃酸(AAI)肾毒性研究中发现了肾皮质区的代谢改变较肾外髓质和肾髓质间更为明显^[8], 提示AAI的毒性靶区主要为肾皮质区, 为进一步明确毒性靶点奠定了基础。此外, 空间代谢组学的超高分辨技术, 如二次离子质谱成像(SIMS-MSI)已将空间分辨率提升至20~50 nm, 但受限于代谢物覆盖种类(仅100~200种)和定量误差(20%~30%)^[9]。最后, 从数据分析角度来看, 传统代谢组学依赖一维数据——代谢物浓度, 通过主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)等数据模型即可完成分类分析, 而空间代谢组学需处理三维数据, 结合深度学习算法解析空间模式, 计算时间长, 分析难度大, 但却能提供更深更广的代谢信息。综上所述, 空间代谢组学在揭示组织代谢异质性方面具有强大的优势, 对于分析暴露于毒性物质前后的生物体代谢物空间分布变化, 将代谢物及其生物学功能相关联, 更为精准、科学地解析药物的毒性机制有很大帮助。因此, 文章对空间代谢组学的原理、技术流程进行总结, 并从中药、化学药物、农药和慢性环境暴露毒性4个方面对空间代谢组学的应用进行了探讨, 其中中药因成分和机制的复杂性被重点讨论, 包括空间代谢组学在其毒性机制研究和炮制减毒两方面的应用, 而其他3类毒性物质成分单一且机制较为明确, 因此在文章中的探讨相对简单。最后, 文章对空间代谢组学在毒性研究中的优势和挑战进行了思考和展望, 为探索基于空间代谢组学技术的毒性研究提供理论参考。

1 空间代谢组学的概述 1.1 空间代谢组学的原理

空间代谢组学将电离技术与MSI相结合, 筛选差异代谢物的同时创建代谢物分布图像^[10]。与传统方法不同, MSI将代谢物从微米级组织切片的表面原位解吸和电离, 产生的气相离子束转移到质量分析仪, 同时通过移动样品台或改变质谱仪的检测位置, 可以在组织样本不同的空间点上进行离子化检测, 从而获得整个样品表面的代谢物分布图^[11]。

1.2 空间代谢组学的技术分类

空间代谢组学基于无标记的MSI技术允许直接从组织切片对大量代谢物和药物进行空间映射。根据离子化原理及样品处理方式将MSI的模式分为以下几种: 基质辅助激光解吸电离质谱成像(MALDI-MSI)、电喷雾解吸电离质谱成像(DESI-MSI)、空气动力辅助解吸电喷雾质谱成像(AFADESI-MSI)、SIMS-MSI、常压基质辅助激光解吸电离质谱成像(AP-MALDI-MSI)、电喷雾激光解吸电离质谱成像(ELDI-MSI)和激光烧蚀电喷雾电离质谱成像(LAESI-MSI)等^[11]。其中应用最广的是MALDI-MSI和DESI-MSI。MALDI-MSI是一种矩阵依赖技术, 凭借高灵敏度和高空间分辨率, 使用激光对组织中的代谢物进行可视化^[12-13], 但由于该技术需要在样本表面涂覆基质, 形成一层均匀的薄膜以保护样品并吸收激光, 这不可避免地影响代谢物的解吸和电离效率, 并有可能引入基质信号进而增加数据分析的复杂性, 此外, MALDI-MSI在检测小分子(< 600 Da)方面存在一些困难。因此, 一种具有高覆盖率且几乎不需要基质辅助电离的技术应运而生——DESI-MSI。该技术不需要复杂的样品制备步骤, 可以在常温常压的空间环境下使用电喷雾电离直接对组织切片进行成像^[10], 实现快速且破坏性最小的化学筛选。此外, 较为常见的AFADESI-MSI是基于DESI-MSI发展而来, 具有更广泛的覆盖范围, 除具有DESI-MSI的优点外, 还提高灵敏度和空间分辨率, 可以在非靶向分析可同时视化数千种代谢物, 但该技术面临数据分析复杂、设备成本及维护要求高等挑战^[13]。MSI样品制备、电离方式、分辨率以及各个模式的优缺点^[14-17], 见表 1。

1.3 空间代谢组学技术流程

空间代谢组学的研究流程主要包括组织样本获取、切片制备、质谱数据采集和成像数据分析^[18]。如图 1所示^[19-20], 首先需要采用合适的方法制备生物组织样本并进行预处理。在切片制备过程中, 冷冻或包埋处理的样本采用冷冻切片机切成厚度在5~20 μm的均匀组织切片, 随后采用融裱法、胶带法等方式将冷冻切片转移至质谱靶上。但在质谱成像仪扫描采集质谱数据之前, 需要根据采用的质谱成像技术对切片进行相应的预处理。这些技术都接受冷冻或FFPE组织, 但MALDI-MSI需要一个额外的基质沉积步骤。需要注意的是, 用于包埋组织和作为MALDI-MSI基质的材料会干扰代谢物检测, 所以需要设有阴性对照成像^[1]。样本数据经质谱扫描仪采集后, 需要对数据进行批量读取、背景扣除、数据筛选及生成图像等, 最后根据质谱成像对组织代谢物等进行时空分布研究。

2 空间代谢组学在毒性研究领域的应用 2.1 空间代谢组学在中药毒性研究中的应用

中药毒性研究是中药走向现代化和国际化的关键环节, 但由于中药成分复杂、作用机制多样, 传统的代谢组学技术在揭示其毒性机制时存在局限性。传统代谢组学均质化处理样本, 无法反映代谢物在组织中的空间分布异质性。空间代谢组学技术的出现, 弥补了这一不足。它通过结合MSI技术, 在组织切片上原位检测代谢物的空间分布, 揭示毒性物质在特定组织区域的代谢变化, 为中药毒性机制的研究提供了全新的视角。近年来, 空间代谢组学在中药毒性研究中的应用逐渐增多, 尤其是在毒性机制解析和毒性成分的空间分布可视化方面展现了巨大的潜力。

2.1.1 空间代谢组学在中药毒性机制研究中的应用

空间代谢组学在中药毒性机制研究中能够深入揭示毒性中药的代谢机制, 特别是代谢变化与特定组织区域及关键代谢途径之间的关系, 为中药毒性作用机制的研究提供了全新的视角。例如, Wang等^[8]结合气流辅助解析电喷雾质谱成像(AFADESI-MSI)技术与超高分辨率(Q-OT-qIT)质谱仪, 揭示了AAI引发的肾毒性空间代谢效应。团队优化了检测条件, 使空间分辨率为10~50 μm, 质谱分辨率为120 000时特异性和灵敏度达到良好的平衡。共检测到38种差异代谢物, 涉及精氨酸-肌酐代谢、尿素循环及脂质代谢等通路。结果显示AAI显著改变肾皮质及髓质的代谢物分布, 其中精氨酸和肌酐浓度较对照组升高2~3倍, 甜菜碱浓度较对照组下调超过50%, 它们的成像区域与组织病理损伤区域高度匹配。此外, 鞘脂类代谢物在损伤边缘的浓度较中心区域高3.2倍。该研究最终揭示了AAI通过抑制肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1)导致脂肪酸代谢异常及线粒体功能障碍, 为药物毒性机制研究提供了高分辨率、高通量的原位分析工具, 并提示脂质代谢物可能作为AAI致肾损伤潜在的生物标志物。另有研究采用AP-MALDI-MSI结合机器学习分析AAI暴露的小鼠肝组织切片, 利用自动化分析的算法成功分析了11 726个像素, 减少了人为干预的同时使AAI暴露组与对照组之间的肝脏组织被有效区分, 准确率达到99.81%, 该研究展现了空间代谢组学与机器学习联合应用在中药毒性研究中的巨大潜力^[21]。除了这些针对特定毒性成分的研究, 另有研究^[22]进一步拓展了空间代谢组学在中药毒性研究中的应用范围。他们结合空间代谢组学和网络毒理学, 深入分析了何首乌70%乙醇提取物(PM-D)的肝毒性。通过空间代谢组学技术检测到大黄素和大黄酚在肝脏中高度富集, 表明PM-D的肝毒性可能与这两种成分密切相关。结果表明精氨酸和鸟氨酸在肝脏边缘区域的浓度显著上调, 牛磺胆酸和牛磺脱氧胆酸在局部区域显著富集, 说明PM-D引起氨基酸代谢紊乱及胆汁淤积性肝损伤。相较于Gong等^[23]利用血清代谢组学技术对PM-D的毒性机制研究, 该研究直观地展示了毒性成分及差异代谢物的空间分布, 有助于更好地理解代谢物与组织结构和功能之间的关系。

2.1.2 空间代谢组学在中药炮制减毒中的应用

中药炮制的核心目的是降低中药的毒性以确保用药安全, 同时改变药物性能, 增强疗效。空间代谢组学能够揭示中药在炮制过程中的成分变化, 特别是毒性成分的空间分布和代谢过程, 提供了一种全新的视角和研究手段, 从宏观视角阐明中药炮制机制。在乌头的炮制减毒研究中, 有研究^[24]基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)结合DESI-MSI可视化技术系统揭示了附子中乌头碱类生物碱的空间分布特征及加工过程中的化学转化规律。成像显示高毒性二酯类生物碱在生附子皮层中均匀分布, 而低毒性单酯类和非酯类生物碱分别富集于表皮/皮层和维管柱区域。UHPLC-QTOF-MS定量分析表明, 加工后生附子中高毒性二酯类生物碱含量降低了5~100倍, 而蒸附子中的含量减少超100倍, 药效成分苯甲酰乌头原碱显著增加。综上分析, 空间代谢组学数据可以进一步指导加工优化: 可剥离双酯类生物碱富集的皮层做单独炮制, 同时保留富含非酯型生物碱的维管柱区域以提高炮制减毒的效率。该研究为附子安全用药和标准化生产提供了精准的空间化学依据。探讨了乌头生品和不同炮制时长的炮制品之间化学成分变化、转化机理和成分的空间分布, 为乌头的最佳炮制时间的确定提供了有利参考。此外, 另1项非常有趣的研究^[25]将高效薄层色谱(HPTLC)与DESI-MS相结合研究乌头不同炮制品中生物碱含量的变化, 首先借助HPTLC法分离炮制品中的成分, 然后借助DESI-MS技术直接在薄层表面可视化化学物质。结果表明, 薄层在荧光扫描下仅可见5个化合物点, 而DESI-MS可原位可视化52个化合物并直观地显示它们的相对含量。该研究证实了HPTLC-DESI-MS是一种简单、快速、节省溶剂的技术, 在中药复杂成分的分离和表征方面具有显著优势, 同时也为开发空间代谢组学的联用技术带来了新的启发。附子是乌头的侧根加工品, 生物碱同样是其主要的毒效成分, Ren等^[26]采用DESI-MSI技术可视化了生附片中不同生物碱的空间分布, 其中二酯类生物碱含量高且分布均匀, 单酯类主要分布在表皮、皮层和维管柱, 而非酯类生物碱含量低且大部分分布在皮层中。明确了生物碱类成分在饮片中的空间分布, 将有助于优化炮制工艺, 提高附子的药效和安全性。

2.2 空间代谢组学在化学药物毒性机制研究中的应用

化学药物是当今应用最广、品类最多的一类药物, 其毒性研究往往依赖体外细胞模型和动物实验, 虽能提供毒性信息, 但难以精确反映药物在组织中的代谢分布及对微环境的动态影响。空间代谢组学技术的引入, 为研究药物毒性机制提供了新工具, 能在不破坏组织结构的情况下, 原位检测药物及其代谢产物的空间分布, 揭示毒性作用的时空动态过程。近年来, 该技术在药物代谢产物分布、毒性靶点定位及机制解析等方面取得显著进展。

Li等^[27]运用3D HepG2模型与空间代谢组学技术, 深入研究了胺碘酮(AMI)的代谢过程和肝毒性效应, 检测到超过1 100种内源性代谢物的空间分布信息, 覆盖了29条代谢途径。同时首次可视化了AMI的15种次级代谢产物的时空分布: AMI在0.5 h内从球体边缘渗透, 4 h扩散至核心, 其代谢产物随时间积累。该研究联合了代谢组学分析, 空间代谢组学优势凸显于代谢异质性解析: 如花生四烯酸在球体核心特异性减少, 而溶血磷脂酰肌醇16:0(m/z 571.288 9)在外层富集。通过多变量回归筛选出FA 20:2等8个脂肪酸生物标志物, 其时空变化与细胞活力高度相关, 精准表征了肝毒性进程。该方法实现了药物代谢、内源性代谢扰动及空间异质性的同步解析, 为体外毒性评价提供了高分辨、高覆盖的代谢组学工具。另有研究^[28]采用AFADESI-MSI技术分析了艾氯胺酮对小鼠大脑代谢的时空特异性影响。数据显示, 艾氯胺酮显著调控整体脑水平的甘油磷脂代谢, 并在大脑腹侧苍白球诱导最显著的鞘脂和膜脂代谢扰动。该研究中空间代谢组学的优势体现在其高分辨率和全脑覆盖能力, 可精准定位代谢网络的空间异质性, 例如发现腹侧苍白球作为关键靶区, 凸显了其在解析复杂脑区代谢动态中的不可替代性。尽管对乙酰氨基酚(APAP)的肝毒性机制已得到深入的研究, 而在空间代谢维度的研究仍然欠缺。Al等^[29]使用AP-MALDI-MSI技术检测到APAP和APAP-半胱氨酸在肾脏的肾盂中大量蓄积, 从新的角度深入阐述了APAP的肾毒性机制的同时, 依据此技术在肾脏中发现了新的代谢物, 并根据谷胱甘肽(GSH)在器官中的分布量可知该物质有助于抑制肝毒性。同时这一点在Ghallab等^[30]APAP过量后肝细胞对胆汁酸的摄取可改善肝毒性研究中亦有所提及, 服用过APAP的模型组中GSH与其结合形成APAP-GSH, 器官中游离的GSH的量相比对照组有所减少, 指出GSH可以抑制APAP所造成的肝毒性。

2.3 空间代谢组学在农药毒性机制研究中的应用

农药的广泛使用对生态和健康构成风险, 研究其毒性机制对科学施药和减轻生态负担至关重要。传统方法依赖生化检测和病理评估, 虽提供基础数据, 但难以精确反映农药在生物体内的代谢轨迹及对组织的实时影响。空间代谢组学技术在不破坏组织完整性的前提下, 实时定位农药及其代谢物分布, 并监测内源性代谢物变化, 揭示毒性时空演变规律。近年来, 该技术在农药代谢物分布、毒性靶点定位及机制解析方面展现出独特优势和应用前景。Li等^[31]利用空间代谢组学和脂质组学证明了鱼藤酮处理的小菜蛾的代谢表达水平和空间分布, 其中空间脂质组学结果表明, 鱼藤酮可能显著破坏小菜蛾细胞膜中的甘油磷脂, 抑制脂肪酸生物合成, 并消耗二酰甘油以增强脂肪氧化。这些研究结果表明, 鱼藤酮对小菜蛾的高毒性可能归因于对能量产生和氨基酸合成的负面影响以及对细胞膜的损伤, 为鱼藤酮对目标害虫的毒性机制和合理开发候选植物源农药提供了指导。Liu等^[32]报道了采用AP-MALDI-MS对暴露于氟虫腈的整个斑马鱼切片进行成像, 该技术方便在整个动物水平上观察氟虫腈暴露引起体内代谢物分布的变化。空间代谢组学的应用不仅是检测代谢物水平变化和空间分布, 还可以进行定量和原位定位分析。Mohammadi等^[33]和Lagarrigue等^[34]分别用MALDI-MSI技术研究了致癌有机氯化农药十氯酮, 基于归一化方法对小鼠肝脏中的十氯酮进行了原位成像和定量研究, 为空间代谢组学技术的定量研究提供了参考。

2.4 空间代谢组学在环境毒理学中的应用

环境暴露是指个体或生物体与环境中的有害物质或因素接触或暴露的过程, 其对人类健康构成的潜在威胁是1项紧迫的公共卫生议题^[35], 因此, 针对环境暴露毒性的深入研究对于保护人类健康免受其影响具有重要意义。空间代谢组学技术为环境毒理学研究提供了新工具, 可在保持组织完整性的同时, 原位分析环境污染物及其代谢产物的分布, 并整合内源性代谢物变化, 动态解析毒性作用的时空特征。近年来, 该技术在环境污染物代谢产物分布、毒性靶点定位及机制解析等方面取得显著进展, 展现了其在环境毒理学研究中的独特价值。

三氯生(TCS)作为1种广谱抗菌剂被广泛应用于各种工业和消费品中, 极易富集在人体内, 对健康产生威胁。Chen等^[36]使用MALDI-MSI技术揭示TCS及其代谢物在乳腺癌细胞球体中的时空分布差异, 发现外周区域能量供应增强, 内部坏死区域通过积累三酰甘油增强了能量储存, 这突破了传统代谢组学的均质化局限, 首次在三维模型中定位能量代谢与脂质积累的空间异质性, 阐明TCS通过"外周供能-内部储能"协同作用促进肿瘤生长的机制, 为环境污染物内分泌干扰效应研究提供了新视角。此外, 镉(Cd)是天然存在的过渡金属, 生物富集引起的急性和慢性毒性已成为一个重大的公共卫生问题。Deng等^[37]的研究通过空间代谢组学的方法揭示了Cd暴露对小鼠肾脏和肾小管上皮细胞代谢谱的影响, 特别是与GSH氧化还原失衡和6次跨膜上皮抗原3(STEAP-3)驱动的溶酶体过载相关的变化, 为理解环境镉暴露引起的肾功能障碍提供了新的见解。另外, 为深入了解镉暴露的毒性机制, 研究人员通过AP-MALDI MSI可视化小鼠肝脏的几种代表性脂质, 发现接触Cd会导致肝脏、心脏和肾脏等所有组织的代谢发生变化, 与炎症反应、能量消耗、氧化应激和线粒体损伤以及脂质稳态密切相关^[38]。这些研究成果增强公众对Cd暴露毒性的认识, 并指导未来的风险评控。

3 总结与展望

空间代谢组学的显著优势在于不破坏组织结构, 避免了传统样品处理方法导致代谢物丢失的前提下, 凭借高空间分辨率保留代谢物的原位信息, 并实现同时捕捉代谢物的空间分布和时间变化, 通过整合内源性代谢物变化趋势和组织病理学特征等多维度信息揭示毒性作用的动态过程。现如今, 空间代谢组学技术在毒性研究中主要应用于中药、化学药物、农药和慢性环境暴露毒性四大领域。其中, 中药与其他3类毒性物质不同, 其成分构成复杂, 相较于成分单一的化学药物、农药和环境毒性因子来说其毒性靶点和作用机制难以明确, 因此更难以形成一套标准化的毒性评价模式。传统代谢组学通过捕捉毒性反应的生物标志物和次生代谢物之间的分子相互作用, 具有表征中药系统性毒副作用的优秀能力, 然而该技术几乎忽略了细胞和组织层面与代谢物之间的功能联系, 因此从某种程度上来看, 中医的整体观念落实到传统代谢组学技术研究上仍然有所欠缺, 相反, 空间代谢组学的引入重新建立起了病理微区和代谢标志物之间的内在联系, 更好地体现了中医的整体观^[39-40]。然而, 尽管空间代谢组学技术在推动四大毒性研究领域的发展中发挥了重要作用, 但其在中药毒性研究中的应用仍面临挑战。中药复杂的成分和多样化的代谢特征难以在同一切片中全面呈现, 且空间代谢组学在中药配伍减毒研究中的应用几乎空白。

展望未来, 机器学习技术的引入可以显著提升空间代谢组学数据分析的效率和准确性, 帮助科学家发现新的生物标志物或代谢途径^[41-42]。此外, 结合稳定同位素示踪技术与空间代谢组学可以在空间分辨水平上定量哺乳动物组织中不同代谢途径的动态变化^[43], 如此为研究提供了更多的信息, 更清晰、具体地反映了一个动态的代谢过程, 为药物新靶点发现和理解药物作用机制提供了新的思路。通过技术创新和多学科交叉融合, 空间代谢组学有望在毒性机制解析、毒性靶点定位及毒性评价模式优化等方面取得更大突破。