国际癌症研究机构统计数据表明，2022年全球新增近2 000万癌症确诊病例和970万癌症死亡病例，其中乳腺癌以11.6%的新增病例比例占据第2位^[1]，是女性癌症死亡的首要原因。三阴性乳腺癌（TNBC）即雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体-2（HER-2）均表达缺陷的一种乳腺癌亚型，具有异质性强、最具侵袭性、术后复发率高、病死率较高的特点^[2]。由于对传统的内分泌治疗和HER-2靶向药物不敏感，治疗TNBC的首选方案是手术治疗和化学治疗，但手术无法彻底规避残留癌细胞，增加术后远处转移、局部复发风险^[3]。常规化学治疗预后较差，且会引发骨髓抑制、乏力、食欲下降等毒副作用，并易产生耐药性^[4]。单一手段不足以治疗TNBC，因此联合治疗可能是改善TNBC的更好选择^[5-6]。然而，目前多数治疗方案尚未形成标准化体系，已经获批的联合用药方案仅能使少数患者受益，亟需通过寻找新的药物和创新作用机制来提高临床疗效。

鸦胆子是植物Brucea javanica（L.）Merr.的干燥成熟果实，具有清热解毒功效。现代研究表明其具有抗肿瘤、免疫调节和抗炎的药理活性^[7]。鸦胆子油乳是以鸦胆子果实为原料、由石油醚提取制备而成的中成药，临床上已经用于肺癌、肝癌、乳腺癌和消化道癌症的联合治疗，通过抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移，诱导肿瘤细胞凋亡及自噬，调节机体免疫功能、放射治疗与化学治疗增敏及抗肿瘤耐药多种机制发挥作用^[8]。

一直以来，对中药材的制备多以水和酒两种主要溶剂为主，采用不同溶剂所获得的提取物中有效物质的含量、种类均会发生显著变化，导致作用效果和机制有所差异。香港中文大学首次揭示了鸦胆子水提物可以诱导胰腺癌细胞发生凋亡，开启了鸦胆子提取物在癌症领域的研究先河^[9]。Kim等^[10]研究表明鸦胆子水提物通过靶向肺癌细胞突变的表皮生长因子受体（EGFR）抑制肿瘤生长，可以作为克服接受靶向治疗的患者耐药性的良好候选。此外，在动物模型中，口服鸦胆子水提物可以通过降低耐药性与诱导凋亡抑制肿瘤生长^[11]。Lau等^[9]报道了鸦胆子水提物对3种胰腺癌细胞系PANC-1、SW1990和CAPAN-1具有细胞毒性作用，并且可以诱导凋亡和基因组DNA的断裂。Kapchan等^[12]发现鸦胆子醇提物对Walker-256肉瘤、人鼻咽癌细胞和淋巴细胞性白血病等均存在明显抑制作用。Wang等^[13]研究表明鸦胆子醇提物抑制了血小板衍生生长因子受体β（PDGFR-β）介导的血管内皮细胞的血管生成功能，并推测这可能有助于其对恶性肿瘤发挥治疗作用。Jung等^[14]研究证实鸦胆子醇提物对人T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞生长和炎症存在抑制作用，并验证了其作为抗白血病药物的疗效。此外，鸦胆子醇提物抑制了核转录因子-κB（NF-κB）信号通路和酪蛋白激酶2（CK2）介导的信号通路，从而诱导凋亡^[15]。Bagheri等^[16]研究表明鸦胆子醇提物通过影响线粒体和外源途径凋亡，对HCT-116结直肠癌细胞具有潜在的抗增殖与凋亡活性。最新研究还发现，鸦胆子衍生的外泌体样纳米囊泡（BF-Exos）可以递送功能性微小RNA（miRNA），通过调节活性氧（ROS）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）介导的凋亡通路及抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号，显著延缓4T1小鼠模型的肿瘤生长与转移^[17]。

近年来，鸦胆子提取物在TNBC治疗中的潜力逐渐显现，涉及的机制包括诱导细胞凋亡与周期阻滞、调控关键信号通路、抗血管生成与免疫调节和逆转化学治疗耐药性^[8]。Chen等^[18]、Luo等^[19]发现鸦胆子醇提物和其主要成分之一苦素D可以通过PI3K/Akt/mTOR途径抑制自噬和能量代谢，从而抑制TNBC细胞。Lau等^[20]报道了鸦胆子温水提取物的抗癌活性，通过激活MDA-MB-231细胞中caspase-3激活相关的线粒体依赖性途径和caspase-8蛋白，显示出抗增殖与凋亡诱导活性。然而，鸦胆子醇提物治疗TNBC的体内药效和潜在机制尚不清楚，阻碍了其临床应用。

基于上述问题，本研究旨在以TNBC细胞系和4T1荷瘤小鼠为模型，系统评估鸦胆子醇提物在体内外抑制TNBC增殖的能力；进一步采用RNA测序技术探究鸦胆子醇提物抗TNBC的潜在分子机制；结合流式细胞术、实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）法对分子机制进行验证，为进一步开发新的TNBC治疗药物提供理论依据。

1 实验材料 1.1 细胞和动物

雌性BALB/c小鼠（6~8周龄）购自北京维通利华实验动物技术有限公司，使用许可证号：SCXK（京）2021-0006。于天津中医药大学医学实验动物中心SPF级饲养室（湿度50%，温度22~25 ℃）饲养。动物的使用经过天津中医药大学实验动物伦理委员会批准，动物实验伦理审查编号：TCM-LAEC2023247d1619。从美国ATCC生物标准品资源中心购买鼠源4T1细胞系和人源MDA-MB-231细胞系。

1.2 主要试剂

二甲基亚砜（DMSO）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒和4%组织细胞固定液来源于北京索莱宝科技有限公司，货号分别为D8371、P1020、PC0040、P1110；阿霉素（Dox）来源于美国MedChemExpress生物科技公司，货号HY-15142；0.25%胰蛋白酶（货号C3530）、DMEM培养基（货号C3113）、RPMI 1640培养基（货号C3010）购买于上海逍鹏生物科技有限公司；胎牛血清（FBS，货号WS500T）购买于上海威正翔禹生物科技有限公司；CCK-8试剂盒（货号HY-K0301）源于美国MedChemexpress生物科技公司（MCE）；结晶紫染液（货号C0121）购买于上海碧云天生物技术有限公司；TRNzol Universal总RNA提取试剂（货号DP424）购买于北京天根科技有限公司；10%高分辨率预制胶（货号36246ES10）购买于翌圣生物公司；Bcl-2相关X蛋白（Bax，货号2772）、B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2，货号3498）、NF-κB P65（货号4764）购买于CST公司；StarScript Ⅲ反转录试剂盒（货号A232-10）、2×Real Star Fast染料法qPCR预混液（货号A303-10）购买于康润生物公司；鸦胆子产地为广西壮族自治区玉林市玉州区，经天津中医药大学常艳旭教授鉴定为鸦胆子Brucea javanica（L.）Merr.果实。

1.3 主要仪器

冷冻离心机（eppendorf，型号：5810R）、台式离心机（Thermo Scientific，型号：Micro21R）、酶标仪（TECAN，型号：Spark）、流式细胞仪器（型号：BD Accuri C6 Plus）、倒置显微镜（Nikon，型号：ECLPSE）、电子秤（悦迪，型号：BOLIDA）、电子游标卡尺（德力西，型号：0~200 mm）、NanoDrop分光光度计（Thermo Scientific）、T100^TM PCR仪（Bio-Rad）、伯乐CFX96荧光定量PCR仪、电泳仪（Bio-Rad）。

2 实验方法 2.1 提取物制备

使用粉碎机粉碎鸦胆子药材（1 kg），过24目网筛得到鸦胆子粉末，置于圆底烧瓶中，加入8 L的75%无水乙醇浸泡过夜，采用加热回流法80 ℃提取2 h，冷却后经纱布过滤收集提取液，剩余药渣重复上述提取过程1次，合并两次提取液，于旋转蒸发仪中浓缩两次提取液，收集得到78.7 g干燥提取物，计算得率为7.87%。

2.2 CCK-8实验

为验证鸦胆子醇提物对4T1和MDA-MB-231细胞增殖的影响，采用CCK-8实验检测鸦胆子处理细胞24 h后的细胞活力。将细胞以1.5×10³/孔的密度接种于96孔板，置于37 ℃、5%CO₂细胞培养箱中生长24 h。24 h后配制不同浓度的鸦胆子醇提物（0.1、1、10、50、100、200 mg/L），将旧培养基替换为鸦胆子醇提物继续培养24 h。在相应时间节点弃掉旧培养基，每孔中加100 μL含10 %的CCK-8的DMEM培养基或RIPM 1640培养基，细胞培养箱内避光孵育0.5~1 h，波长设置为450 nm，使用酶标仪测定每组孔内的光密度（OD）。使用以下公式计算细胞活力。

$ \text { Cell } Viabitity (\%)=\frac{O D(\text { 药物 })-O D(\text { 空白 })}{O D(\text { 对照 })-O D(\text { 空白 })} \times 100 \% \text { 。} $

2.3 克隆形成实验

4T1和MDA-MB-231细胞以1 000个/孔的密度铺在6孔板中，待细胞贴壁后，更换为含有鸦胆子醇提物的完全培养基，每3天更换培养液1次。14 d后终止给药，吸弃培养上清，PBS润洗3次，在室温下用4%多聚甲醛固定15 min。PBS润洗3次，室温条件下在结晶紫染液中浸泡10 min。纯水清洗3~5次，拍照并计数。

2.4 形态学观察

4T1和MDA-MB-231细胞以2×105/孔的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，将旧培养基换成由完全培养基配制的鸦胆子醇提物（10、20 mg/L），给药24 h后，移至倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍照。

2.5 流式细胞术检测细胞凋亡情况

4T1和MDA-MB-231细胞以2×10⁵的密度接种于6孔板，待细胞贴壁后将旧培养基换成由完全培养基配制的鸦胆子醇提物（10、20 mg/L）。药物处理24 h后收集上清液，1 mL预冷的PBS润洗细胞，加入胰酶消化细胞，随后加入完全培养基终止消化并收集至离心管中，4 ℃、1 000 r/min离心3 min（离心半径18 cm），弃上清。加入1 mL的PBS清洗细胞1次。加入适量1×binding buffer重悬细胞后转移至流式管中，使用Annexin V-FITC/PI试剂盒对细胞进行染色，设置裸细胞组、单染组作为对照，室温避光孵育15 min，每管加入400 μL的1×binding buffer重悬细胞，使用流式细胞仪检测。

2.6 造模方式及分组

常规培养4T1细胞，收集对数生长期的4T1细胞，PBS清洗两次（1 000 r/min，3 min），将4T1细胞皮下注射到BALB/c小鼠的腋窝中（每只小鼠2×10⁵个细胞）。当平均肿瘤体积达到约100 mm³时，将小鼠随机分为4组：模型组、阿霉素组、鸦胆子醇提物低剂量组、鸦胆子醇提物高剂量组，每组6只。

2.7 给药方式

根据《中华人民共和国药典》记载的鸦胆子临床使用剂量（0.5~2 g），选取最大剂量2 g换算为小鼠等效剂量，鸦胆子醇提物的临床等效剂量为20 mg/kg。待肿瘤生长至适宜体积后，开始进行药物干预，模型组给予生理盐水，阿霉素组腹腔注射1 mg/kg阿霉素，鸦胆子醇提物组采取灌胃给药，低剂量组为20 mg/kg，高剂量组为60 mg/kg，连续给药14 d，每日给药1次。

2.8 小鼠活动状态观察及相关指标检测 2.8.1 小鼠活动状态记录

每天观察小鼠的活动与饮食状态。

2.8.2 体质量及肿瘤体积测量

每3天测量1次小鼠体质量、肿瘤组织长径及短径。使用公式计算肿瘤体积（mm³），并生成肿瘤生长曲线。

$ V=\frac{1}{2} \times a \times b^2 \text { ，其中 } V \text { 为体积，} a \text { 为长径，} b \text { 为短径。} $

2.8.3 肿瘤质量及记录

末次给药24 h后脱颈处死小鼠，剥离肿瘤称取质量并拍照记录。

2.9 RNA测序 2.9.1 RNA测序的样品制备

液氮研磨肿瘤组织至粉末状，加入1 mL的Trizol裂解液充分匀浆，转移至1.5 mL的EP管室温静置5~10 min；4 ℃、10 000 r/min离心5 min（离心半径5.1 cm），取上清，加入200 μL氯仿，剧烈震荡混匀后相同条件离心10 min，取上清加入等体积异丙醇，-20 ℃沉淀1 h，离心20 min后，75%乙醇洗涤沉淀，DEPC水溶解RNA，测定浓度和纯度。

2.9.2 文库定量与质量检测

Oligo（dT）磁珠富集mRNA；二价阳离子溶液片段化；随机引物逆转录合成第一链cDNA；RNase H消化RNA链后合成第二链；末端修复、加A尾并连接测序接头；PCR扩增后选择200 bp片段；质检合格（浓度≥2 nmol/L）后上机测序。原始数据质量控制：过滤低质量reads（Q20≥90%）；序列比对：使用HISAT2将clean reads比对至参考基因组；表达定量：采用FPKM方法计算基因表达水平。

2.9.3 差异表达基因分析

使用诺禾云平台（https://magic.novogene.com）对实验组和对照组的差异基因进行分析。差异基因筛选标准为：|FC|≥1.2且P < 0.05。采用火山图展示差异表达基因。

2.9.4 京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析

使用诺禾云平台对差异表达基因进行KEGG富集分析，以此筛选显著富集通路，从而直观反映差异基因与生理活动的关联。

2.10 RT-qPCR

取50 mg小鼠肿瘤组织，根据TransZol操作说明，提取总RNA。取1 μL总RNA样品，测定总RNA浓度。根据测定结果，将所有浓度调至500 ng/μL。按照操作说明合成cDNA，产物于-20 ℃保存备用。小鼠Bax、Bcl-2、caspase-3、GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表 1。以cDNA为模板，RT-qPCR法检测Bax、Bcl-2和caspase-3 mRNA表达量。反应体系为20 μL：2×Tran Start Tip Greenq PCR Super Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA为1 μL，双蒸水为8 μL。扩增程序采用3步法：95℃ 120 s、95℃ 15 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s，共40个循环。每个样品重复3次，反应结束后观察扩增曲线和溶解曲线，采集Ct值。选用2^-ΔΔCt法进行数据处理。

2.11 Western blot法检测TNBC细胞中Bcl-2、Bax、NF-κB蛋白表达情况

收集细胞上清液，用预冷的PBS润洗两次收集至离心管，细胞刮刀收集各组细胞。4 ℃、12 000 r/min离心10 min（离心半径5.1 cm）后加入细胞裂解液，冰上裂解45 min，中途用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。4 ℃、12 000 r/min离心10 min（离心半径5.1 cm），收集上清液。BCA法测定蛋白含量，凝胶电泳，转印至PVDF膜，转印结束后取出PVDF膜，将转印好的膜加入5%脱脂牛奶室温封闭2 h。除去5%脱脂牛奶，加入一抗4 ℃过夜。用TBST洗涤4次，每次5 min。加入稀释好的二抗，室温孵育30 min，使用TBST在室温摇床上洗涤4次，每次5 min。在电化学发光（ECL）液中浸泡后显影，分析目标条带灰度值。

2.12 统计学分析

采用GraphPad Prism软件进行数据分析。数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，多个时间节点比较采用重复测量方差分析。以空白对照组或模型组为对照，P < 0.05为差异具有统计学意义。

3 实验结果 3.1 鸦胆子醇提物对TNBC细胞增殖及克隆能力的影响

采用CCK-8法检测鸦胆子醇提物对TNBC细胞增殖的抑制作用，图 1A显示，当用较低浓度（0.1 mg/L）鸦胆子醇提物处理时，细胞存活率与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。当鸦胆子醇提物浓度升高至1 mg/L时，细胞存活率开始降低（P < 0.05）；且随着浓度提升，细胞存活率降低更加显著（P < 0.01），这表明鸦胆子醇提物对TNBC细胞具有显著的细胞毒性作用。由图 1B可知，鸦胆子醇提物对4T1的IC₅₀值为85.33 mg/L，对MDA-MB-231细胞的IC₅₀值为26.59 mg/L，表明在此浓度下鸦胆子醇提物可以有效抑制50%TNBC的细胞活力。图 2表明鸦胆子提取物可以降低两个细胞系的克隆形成能力。

3.2 鸦胆子醇提物对TNBC细胞形态的影响

通过倒置显微镜观察发现，经鸦胆子醇提物处理24 h后，4T1细胞和MDA-MB-231细胞均表现出显著的形态学改变。图 3显示，与对照组比较，鸦胆子醇提物组呈现以下特征性变化：细胞密度显著降低，贴壁细胞数量明显减少；细胞形态由典型的梭形变为圆形，体积明显缩小；培养液中漂浮的细胞碎片显著增加。这些形态学改变与细胞凋亡的典型特征高度一致。

3.3 肿瘤质量、体积及小鼠体质量测量

小鼠肿瘤体积的生长趋势见图 4A。第8天时，各组与模型组比较，虽然差异未显示出统计学意义（P>0.05），但是存在抑制肿瘤生长的趋势；第11天以后，与模型组比较，鸦胆子醇提物高剂量组、低剂量组、阿霉素组均能够显著抑制肿瘤生长，差异具有统计学意义（P < 0.05）。

与模型组比较，鸦胆子醇提物高、低剂量组与阿霉素组均能够显著降低肿瘤质量，差异具有统计学意义（P < 0.01），抑制率分别达到37.90%、74.78%和73.14%，见图 4B、图 4C。

图 4D显示，给药干预期间，模型组和鸦胆子醇提物组的小鼠体质量无显著变化，但阿霉素组小鼠体质量持续降低，可能与其心肌毒性有关。

3.4 转录组测序结果

对模型组和鸦胆子醇提物组的测序结果进行比对分析，筛选条件设置为|FoldChange|>1.2且P < 0.05，由此共获得1 892个显著差异表达的mRNA，包括1 130个上调表达的mRNA和762个下调表达的mRNA，其余21 778个mRNA未发生显著表达变化（图 5A）。图 5B是基于上述差异基因进行KEGG富集分析的气泡图。差异基因显著富集在凋亡通路（如Bax、Bcl-2、caspase-3），这些基因的异常表达或功能失调是TNBC恶性进展和耐药的重要机制。Bax通过线粒体途径诱导细胞凋亡，具体表现为促进线粒体外膜通透性增加，释放细胞色素C到细胞质中，激活caspase级联反应。Bcl-2则通过抑制线粒体膜电位丧失和细胞色素C释放，阻止caspase激活，从而抑制凋亡。caspase-3是凋亡执行阶段的关键蛋白酶，负责切割多种底物，导致DNA断裂与细胞解体。此外，氧化磷酸化相关基因（NDUFB6、ATP5F1）的下调提示线粒体能量代谢受到抑制，而内质网应激基因（ATF6、Bax）的富集表明未折叠蛋白反应可能放大凋亡信号。上述结果表明，鸦胆子醇提物对4T1肿瘤细胞的调控作用可能是通过影响与凋亡相关的肿瘤信号通路以及细胞应激等多个作用机制而实现的。

3.5 鸦胆子醇提物对4T1肿瘤组织凋亡相关mRNA表达的影响

RT-qPCR结果表明，经20、60 mg/kg鸦胆子醇提物治疗后，可以显著下调肿瘤组织中Bcl-2 mRNA的表达，上调caspase-3和Bax mRNA的表达。Bcl-2下调和caspase-3、Bax上调可以促进TNBC细胞凋亡。见图 6。

3.6 鸦胆子醇提物对TNBC细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响

Annexin V-FITC/PI双染经流式细胞仪检测鸦胆子醇提物对TNBC细胞凋亡情况的影响。结果显示，10、20 mg/mL鸦胆子醇提物分别作用于4T1和MDA-MB-231细胞24 h后，细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均显著高于对照组（P < 0.01），且呈剂量依赖性。上述结果表明，鸦胆子醇提物可以诱导TNBC细胞4T1和MDA-MB-231凋亡。见图 7。

在4T1细胞中，鸦胆子醇提物高剂量组Bax的表达显著高于空白对照组（P < 0.05），Bcl-2和NF-κB的表达显著低于空白对照组（P < 0.05），鸦胆子醇提物低剂量组对Bax蛋白表达影响不显著。在MDA-MB-231细胞中，鸦胆子醇提物低剂量和高剂量组Bax的表达均显著高于空白对照组（P < 0.01），鸦胆子醇提物高剂量组Bcl-2的表达显著低于空白对照组（P < 0.05），但鸦胆子醇提物组对NF-κB蛋白的表达差异不明显，可能是不同细胞系对药物敏感性不同导致。见图 8。

4 讨论

TNBC仍然是复发率与病死率最高的乳腺癌亚型，占新诊断乳腺肿瘤的24%^[21]。由于缺乏明显的生物靶点或标志物，TNBC治疗策略多年来以化学治疗为主，但总体预后较差。目前，新型药物（免疫检查点抑制剂等）的最新进展已经针对PD-L1⁺肿瘤或种系Brca突变肿瘤的特定亚组，在癌症治疗方面取得了前所未有的进展^[22]，但是只有少数患者对免疫检查点或聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂（PARP）抑制剂存在反应，也经常出现耐药和复发，并且可能发生免疫相关不良事件，从而中止治疗^[23]，因此仍然需要寻找新药物、新方法、新机制来为TNBC的治疗提供帮助。

中药因其多靶点和低毒性的特点，可以单独或与放射治疗、免疫治疗、化学治疗联合使用^[24]。近年来，实验室越来越多的研究都发现了中药的药用价值，在中药中寻找抗癌药物已经成为潜在策略。在中国，中药鸦胆子的石油醚提取物被开发为鸦胆子油乳注射液和鸦胆子油软胶囊，在临床上用于治疗恶性肿瘤，提高了总体治愈率，增加了CD3⁺和CD4⁺细胞数量，减少了手术后的不良反应^[8]。传统中药材一般选择水煎煮，可以将苷类、有机酸盐、鞣质、蛋白质、色素、多糖类等亲水物质提取出来，但水提的选择性较差，容易浸提出大量无效物质；中药中的亲水性成分以及一些难溶于水的亲脂性成分在乙醇中均存在一定溶解性，醇提能够获得与水提物成分、含量有很大差距的提取液。根据相似相溶原理，不同提取方法所得到的提取物含有不同的单体成分及比例，因此也具有不同药效。本研究通过加热回流法，选用75%乙醇作为溶剂，制备了鸦胆子醇提物，在细胞水平上验证其抗TNBC药效。CCK-8和克隆形成实验结果表明鸦胆子醇提物可以抑制TNBC细胞增殖，这些结果与前期报道的研究内容一致^[18]。此外，本研究首次验证了鸦胆子醇提物对4T1荷瘤小鼠模型肿瘤生长的抑制作用，实验结果表明鸦胆子醇提物临床等效剂量（20 mg/kg）和临床3倍剂量（60 mg/kg）的平均抑瘤率分别是37.90%和74.78%。

转录组测序技术可以在整体水平上探索基因的功能和结构，揭示特定生物过程的分子机制。本研究首次从组学层面，利用转录组学测序技术分析鸦胆子醇提物在体内抗TNBC的机制，结果提示鸦胆子醇提物可以通过多个机制发挥抗TNBC作用，包括与细胞增殖相关的通路、凋亡、内质网应激，此外还可能通过肿瘤坏死因子（TNF）信号通路和白细胞介素-17（IL-17）信号通路影响机体免疫。测序结果表明，鸦胆子醇提物能够使凋亡相关的基因发生显著变化，如促凋亡基因Bax、caspase-3的上调及抗凋亡基因Bcl-2的下调，同时铁死亡通路关键基因——自噬相关蛋白5（ATG5）被激活，提示鸦胆子醇提物的抗肿瘤机制可能涉及铁死亡。在此基础上，本实验进一步探究鸦胆子醇提物对TNBC细胞的凋亡诱导机制。引起细胞凋亡的途径包括线粒体通路、死亡受体通路和内质网应激通路，而线粒体途径在介导细胞凋亡中承担重要角色。Bcl-2家族蛋白由抗凋亡蛋白（如Bcl-2）和促凋亡蛋白（如Bax）构成，作为线粒体外膜完整性的调节器，在线粒体依赖性凋亡通路中发挥关键作用。当细胞接受凋亡刺激时，细胞质内的Bax蛋白转移至线粒体，与此同时，Bcl-2通过促使细胞色素C向细胞质释放，激活procaspase-9的自剪切过程，活化的caspase-9进一步催化caspase-3的级联反应，最终启动细胞程序性死亡机制^[25]。因此，本研究进一步研究了鸦胆子醇提物是否通过Bax、Bcl-2和caspase-3等基因诱导TNBC细胞凋亡。

Lau等^[20]研究表明，鸦胆子水提物通过线粒体途径激活caspase-8诱导TNBC细胞凋亡。在本研究中，通过RT-qPCR观察到鸦胆子醇提物可以提高4T1肿瘤组织中Bax及其下游caspase-3的表达水平，降低Bcl-2的表达，最终导致细胞凋亡发生。Western blot实验结果显示，鸦胆子醇提物可以增加4T1、MDA-MB-231细胞中Bax蛋白的表达水平，降低Bcl-2蛋白表达。此外，同时检测到NF-κB蛋白表达降低。细胞凋亡与NF-κB信号通路的异常调控在TNBC的发生、发展中密切相关，而NF-κB通过激活下游靶基因（如Bcl-2家族成员）抑制线粒体凋亡途径。本实验结果表明，鸦胆子醇提物能够通过下调4T1中NF-κB蛋白的表达从而促进细胞凋亡。这些结果与近期关于鸦胆子提取物调控凋亡通路的研究趋势一致^{[9-11, 14-16, 20]}。

综上所述，本研究表明，鸦胆子醇提物通过以下机制发挥抗TNBC的作用：在体外显著抑制4T1、MDA-MB-231细胞增殖，并引发细胞破碎、皱缩等形态学变化；在体实验表明，临床等效剂量（20 mg/kg）和3倍剂量（60 mg/kg）的鸦胆子醇提物抑瘤率分别为37.90%和74.78%，且未显著影响体质量；RNA测序揭示其通过激活凋亡通路，并协同调控铁死亡与内质网应激过程；RT-qPCR证实了其对Bax、Bcl-2和caspase-3 mRNA水平的影响，流式细胞术和Western blot证实4T1、DA-MB-231细胞通过NF-κB/Bax/Bcl-2途径诱导凋亡，凋亡率分别高达16.9%和10.7%。然而，当前数据集中于细胞水平和肿瘤体积测量，未来需要通过流式细胞术量化肿瘤浸润淋巴细胞，以全面评估免疫激活效果。此外，粗提物具有成分复杂性，鸦胆子醇提物中究竟何种成分发挥主要抗癌作用仍然需要进一步证实，未来研究将聚焦鸦胆子醇提物成分解析与靶点鉴定，分离鉴定主要活性成分（如苦木素类化合物），并通过分子对接技术筛选潜在靶点蛋白，提出制剂优化路径，从而加快推进临床转化进展。