菟丝子为旋花科植物南方菟丝子Cuscuta australis R.Br.或菟丝子Cuscuta chinensis Lam.的干燥成熟种子，作为补益良药，它是五子衍宗丸、七宝美髯丹等经典名方的重要组成药物，具有内服补肝益肾、固精明目、轻身延年、外用消风祛斑等功效^[1-2]。菟丝子的主要活性成分包括黄酮类、生物碱类、多糖类，具有保护生殖系统、调节免疫、抗氧化、抗肿瘤等药理活性^[3]。2002年菟丝子已经被收录在中华人民共和国国家卫生健康委员会公布的可以用于保健食品的中药名单中，意味着菟丝子在食品、药品、保健品中具有广阔的发展空间和潜在价值，有待在安全性得以保证的前提下对其活性成分进行深入研究。

在外源性因素（紫外线辐射、药物反应）刺激和内源性因素（糖皮质激素、基因）影响下，皮肤细胞遭受氧化应激、DNA损伤、慢性炎症，引起黑色素细胞过度合成黑色素，并被输送到角质细胞，出现皮肤衰老和色素沉着^[4-6]，皮肤变黑伴随着产生雀斑、老年斑，严重情况下甚至对患者造成心理创伤，影响生活质量。近年来，医疗美容行业快速发展，打破以化学合成类为主的美白产品，开发毒副作用小、安全性高的天然药物活性成分抗氧化、美白研究逐渐成为热门，吸引更多科研人员开展研究。

近年有研究表明菟丝子水提物能够抑制黑色素生成^[7-8]，关于菟丝子粗多糖在美白方面的报道及研究较少。本研究通过对菟丝子粗多糖进行提取制备，表征菟丝子粗多糖的单糖组成及分子量，探究其抗氧化与美白效果，为开发菟丝子粗多糖应用于美白护肤和功能食品领域提供一定参考。

1 材料与方法 1.1 材料

药材：菟丝子（亳州市利尔中药材饮片有限公司，产地内蒙古自治区，生产批号230801），药材保存于天津中医药大学研究院。菟丝子原料药材经天津中医药大学李天祥教授鉴定为旋花科植物菟丝子Cuscuta chinensis Lam.的干燥成熟种子。

试剂：293T细胞购自ATCC细胞库；B16黑色素瘤细胞购自北京中源合聚生物公司；野生型AB品系斑马鱼购自北京环特智鱼公司；甲醇（色谱级）购自天津市康科德科技有限公司；浓硫酸（分析纯）购自天津市江天化工技术股份有限公司；苯酚（分析纯）、三氟乙酸（分析纯）购自天津市大茂化学试剂合伙企业；3，5-二硝基水杨酸（分析纯）购自成都市科龙化工试剂厂；黑素细胞刺激素（α-MSH）、左旋多巴（L-DOPA）购自上海源叶生物公司；曲酸（K.A.）购自上海Macklin试剂公司；叔丁基对苯二酚（tBHQ）购自美国Sigma公司；萤火虫萤光素酶报告基因载体pGL4.37、海肾萤光素酶报告基因载体pGL4.75购自美国Promega公司；细胞计数试剂盒-8（CCK-8）试剂盒购自武汉ABclonal生物公司；氢氧化钠（NaOH）、二甲基亚砜（DMSO）购自北京Solarbio科技公司；达尔伯克改良伊格尔（DMEM）培养基、胎牛血清（FBS）购自以色列BI公司；青霉素-链霉素（PS）、0.25%胰酶-EDTA购自美国Gibco公司；双萤光素酶报告基因分析系统E1960购自美国Promega公司。

仪器：旋转蒸发仪OSB-2200、冷冻干燥机FDU-1200（日本EYELA公司）；循环水式真空泵SHB-Ⅲ、低温冷却液循环泵DLSB-5L/25（巩义予华仪器公司）；高速冷冻离心机Sorvall Legend Micro 21R、恒温培养箱HF240（美国Thermo Fisher公司）；多功能酶标仪Victor X2（美国PerkinElmer公司）；热盖金属浴ES1000（杭州瑞诚仪器有限公司）；电子天平BP121S（德国Sartorius公司）；1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司）。

1.2 菟丝子粗多糖提取

参考Sun等^[9]采用的水提醇沉法并稍作修改。取100 g菟丝子按照1∶8的料液比加入纯水，在温度98~100 ℃条件下回流提取30 min，重复3次，合并水提液。将水提液用纱布过滤，随后将过滤液减压浓缩至1 200 mL，加入无水乙醇至3 000 mL（乙醇浓度为80%）。沉淀24 h后进行抽滤，得到灰白色固体。将固体于纯水中溶解，超声20 min，弃去不溶物，随后将其减压浓缩，冷冻干燥得到菟丝子粗多糖样品。

1.3 菟丝子粗多糖含量测定 1.3.1 菟丝子总糖含量测定

采用苯酚-硫酸法测定样品中总糖含量^[10]。精密称定菟丝子样品5.00 mg，加入蒸馏水定容至25.00 mL，取0.10 mL加入0.05 mL的5.0%苯酚溶液和0.25 mL浓硫酸，摇匀后于80 ℃水浴15 min，取出冷却至室温。在波长为490 nm处测定吸光度，设置3组平行对照。按照葡萄糖浓度-吸光度标准曲线计算样品总糖含量。

1.3.2 菟丝子还原糖含量测定

采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定样品中还原糖含量^[11]。精密称定菟丝子样品6.61 mg置于10 mL具塞玻璃试管中，加入蒸馏水1.0 mL溶解，3，5-二硝基水杨酸试剂2.0 mL，沸水浴6 min，冷却后用蒸馏水补足至10.0 mL，充分摇匀，静置10 min，于540 nm处测定吸光度，设置3组平行对照。按照葡萄糖浓度-吸光度标准曲线计算样品还原糖含量。

1.4 菟丝子粗多糖的单糖组成

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化^[12]测定样品中单糖。将2.5 mL的2 mol/L三氟乙酸与2 mg菟丝子粗多糖在105 ℃条件下水解6 h，冷却至室温。溶液中加入甲醇蒸发干燥，并用氮气吹干替换5~7次，至无酸味以除去三氟乙酸残留量。后用200 μL蒸馏水溶解，加入200 μL的0.6 mol/L的NaOH和400 μL的0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，混匀，在70 ℃条件下水浴120 min。冷却至室温后，加入200 μL的0.6 mol/L氯化氢（HCl）溶液中和，后加入氯仿萃取3次，取水层置于0.22 μmol/L滤膜中过滤待用。

色谱检测：采用C₁₈柱（4.6 mm×250 mm，5 μmol/L）和UV检测器（Agilent technologies 1260）进行高效液相（HPLC）分析，条件为流动相：17%乙腈-83%醋酸铵水溶液（0.05 mol/L）；流速：1.0 mL/min；检测波长：250 nm；柱温：30 ℃。

1.5 菟丝子粗多糖的分子量测定

采用尺寸排阻色谱-多角度激光散射结合示差检测器（SEC-MALLS-RI）测定多糖的绝对分子量，采用PL aquagel-OH Mixed-H（8 μm，7.5 mm×300 mm）色谱柱，样品配制成浓度为2 mg/mL溶液，过0.22 μm微孔滤膜后上机测试。流速1.0 mL/min，柱温45 ℃，进样量为50 μL，流动相为0.1 mol/L硝酸钠（0.01%叠氮化钠）梯度洗脱。

1.6 体外抗氧化性能测定 1.6.1 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率

DPPH的测定参考Huang等^[13]方法并稍作修改。将新鲜制备的DPPH（0.2 mmol/L乙醇，0.1 mL）和含有不同浓度的菟丝子粗多糖样品溶液（0.25~5.00 mg/mL，0.1 mL）分别混合摇匀，室温避光孵育30 min，于517 nm处测定吸光度As；用无水乙醇代替DPPH溶液测定吸光度Ab；用纯水代替样品溶液测定吸光度Ac。利用公式（1）计算样品对DPPH自由基的清除活性。

$ \text { DPPH 自由基清除率(%) }=\left[1-\frac{(A s-A b)}{A c}\right] \times 100 \%。$

(1)

1.6.2 2，2’-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）阳离子（ABTS⁺）自由基清除率

ABTS⁺的测定参考Yan等^[14]方法并稍作修改。将5 mL的2，2’-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）水溶液（7 mmol/L）和5 mL过硫酸钾水溶液（2.45 mmol/L）混合均匀，在室温下避光放置12 h，使用磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH=7.4）稀释上述溶液，得到ABTS⁺工作液[使其在734 nm处的吸光度为（0.65±0.05）]。取200 μL的ABTS⁺工作液和20 μL样品溶液（0.25~5.00 mg/mL）混匀，于734 nm处测定吸光度As；用PBS代替ABTS⁺溶液测定吸光度Ab；用纯水代替样品溶液测定吸光度Ac。利用等式（2）计算样品对ABTS⁺自由基的清除活性。

$ \text { ABTS }^{+} \text {自由基清除率(%) }=\left[1-\frac{(A s-A b)}{A c}\right] \times 100 \%。$

(2)

1.7 细胞存活率测定

利用细胞培养技术检测药物对细胞的影响，将293T细胞/B16细胞接种于96孔板内，37 ℃、5%二氧化碳（CO₂）条件下培养24 h，将浓度为100、10、1 μg/mL的菟丝子粗多糖分别加入细胞培养孔中，每孔100 μL。另外设置不加药物的空白对照组，每组设置5~6个复孔，培养24 h。吸弃上清液，每孔加入100 μL的1×CCK-8工作液，避光37 ℃孵育30 min，酶标仪450 nm处测定吸光度，根据说明书计算细胞存活率。

1.8 抗氧化反应元件（ARE）转录活性测定

通过双萤光素酶报告系统检测菟丝子粗多糖对293T细胞的ARE转录活性，293T细胞接种于96孔板内，37 ℃、5%CO₂培养24 h，使用聚乙烯亚胺（PEI）转染pGL4.37和pGL4.75，培养16 h，将浓度为100、10、1 μg/mL的菟丝子粗多糖和10 nmol/L的tBHQ加入细胞培养孔中，每孔100 μL。另外设置不加药物的空白对照组，每组设置5个复孔，培养6 h。吸弃上清液，加入裂解液，振荡裂解30 min后用Dua-Luciferase报告基因分析检测。通过萤火虫萤光素酶活性与海肾萤光素酶活性对比得到相对萤光素酶活性值。

1.9 美白能力测定 1.9.1 斑马鱼美白功效实验

随机选取野生型AB品系斑马鱼置于6孔板中，每孔15尾；给予菟丝子粗多糖样品溶液，同时设置正常对照组。于28 ℃条件下避光孵育45 h，每组随机选取10尾于解剖显微镜下拍照，分析斑马鱼头部黑色素信号强度S，样品组为Ss，正常对照组为Sb。根据公式（3）计算美白功效。

$ \text { 美白功效 }(\%)=\frac{S b-S s}{S b} \times 100 \%。$

(3)

1.9.2 B16细胞黑色素含量

通过α-MSH诱导B16细胞黑色素生成，采用NaOH裂解法^[15]测定体外黑色素含量。B16细胞接种于100 mm细胞培养皿内，37 ℃、5%CO₂培养24 h，用100 nmol/L的α-MSH溶液稀释样品浓度为100、10、1 μg/mL的菟丝子粗多糖和100 μg/mL的曲酸样品溶液，依次加入培养皿内，培养48 h。用胰酶消化收集细胞，每管加入PBS进行混匀，4 ℃条件下13 000 r/min离心10 min（离心半径10 cm）获得细胞黑色素沉淀，加入裂解液（10%的DMSO+90%的1 mol/L的NaOH），混匀后80 ℃金属浴加热90 min，取100 μL细胞裂解液于96孔板内，在405 nm处测定吸光度As；未给药处理的孔作为对照孔，在405 nm处测定吸光度Ab；以裂解液作为空白孔，在405 nm处测定吸光度Ac。利用等式（4）计算黑色素含量。

$ \text { 黑色素含量 }(\%)=\frac{A s-A c}{A b-A c} \times 100 \%。$

(4)

1.9.3 B16细胞酪氨酸酶活性

采用L-DOPA氧化法^[16]测定酪氨酸酶活性。B16细胞接种于100 mm细胞培养皿内，37 ℃、5%CO₂培养24 h，同上述“1.9.2”项给予药物处理，采用胰酶消化收集细胞，PBS润洗1遍，加入裂解液[含1%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）的PBS溶液]，置于4 ℃冰上裂解30 min，4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min（离心半径10 cm），将上清液转移至新的离心管内，加入等体积的5 mmol/L的L-DOPA溶液，37 ℃孵育30 min，在475 nm处测定吸光度As；未给药处理的孔作为对照孔，在475 nm处测定吸光度Ab；以裂解液作为空白孔，在475 nm处测定吸光度Ac。利用等式（5）计算酪氨酸酶活性。

$ \text { 酪氨酸酶活性 }(\%)=\frac{A s-A c}{A b-A c} \times 100 \%。$

(5)

1.10 统计学分析

所有数据采用SPSS 26统计分析软件进行处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，满足正态分布及方差齐性检验时，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析 2.1 菟丝子粗多糖的提取率与含量

称取净菟丝子100 g进行水提醇沉实验得到菟丝子粗多糖11.04 g，提取率为11.04%。采用硫酸-苯酚法绘制葡萄糖浓度（X）-吸光度（Y）的标准曲线方程为Y=3.138 9X+0.082 9（R²=0.997 7），在浓度0.01~0.20 mg/mL与吸收值的线性关系良好，计算得到样品中的总糖含量为（58.73±0.81）%。采用3，5-二硝基水杨酸比色法绘制葡萄糖浓度（X）-吸光度（Y）标准曲线方程为Y=2.993 6X+0.041 5（R²=0.995 5），在浓度0~0.09 mg/mL与吸收值的线性关系良好，计算得到样品中的还原糖含量为（2.70±0.17）%。根据多糖含量=总糖含量-还原糖含量，计算其中的多糖含量为（56.03±0.72）%。

2.2 菟丝子粗多糖的单糖组成

将混合单糖标准品与菟丝子粗多糖样品进行衍生化及色谱分析，离子色谱图见图 1。与混合的单糖标准品比较，菟丝子粗多糖主要由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，比例为1.24∶1.12∶5.32∶15.93∶1.00。

2.3 菟丝子粗多糖的分子量测定

多糖的分子量及其分布范围是多糖的重要结构参数^[17]，采用SEC-MALLS-RI法对菟丝子粗多糖的绝对分子量进行测定，结果显示菟丝子粗多糖的重均分子量（Mw）为74 565 g/mol，数均分子量（Mn）为56 804 g/mol。见表 1。

2.4 体外抗氧化性能 2.4.1 菟丝子粗多糖提高DPPH自由基清除率

研究表明，以中药为原料提取的多糖能够通过清除自由基发挥一定的抗氧化作用^[18]。在浓度为0.25~5.00 mg/mL时，随着菟丝子粗多糖浓度增加，对DPPH自由基的清除能力逐渐增加，具有剂量依赖性。当浓度为5 mg/mL时，清除率达到最高，为95.74%，表明菟丝子粗多糖具有良好的抗氧化活性。见图 2。

2.4.2 菟丝子粗多糖提高ABTS⁺自由基清除率

菟丝子粗多糖浓度与ABTS⁺自由基清除能力呈正相关关系。当样品浓度为5 mg/mL时清除率最高，为86.40%，表明菟丝子粗多糖具有良好的抗氧化活性。见图 3。

2.5 菟丝子粗多糖提高293T细胞中ARE转录活性

ARE作为抗氧化反应元件，激活核因子2相关因子2（Nrf2）-ARE信号通路可以帮助细胞对抗氧化应激等损伤^[19]，基于双萤光素酶报告基因能够筛选具有潜在抗氧化活性的药物^[20]。在菟丝子粗多糖对293T细胞的安全浓度下，与对照组比较，tBHQ能够显著提高ARE转录活性（P < 0.001），100 μg/mL的菟丝子粗多糖溶液显著提高ARE转录活性（P < 0.01）。见图 4。

2.6 菟丝子粗多糖减少斑马鱼体内黑色素生成

斑马鱼与哺乳动物黑色素细胞基因作用一致。斑马鱼幼体皮肤透明，易于观察色素细胞，可以作为筛选药物是否具有美白活性的模式生物^[21]。与正常对照组比较，浓度为31.3 μg/mL的菟丝子粗多糖可以减少斑马鱼头部黑色素信号强度（P < 0.001），美白功效为30%，表明该样品具有美白功效。见图 5。

2.7 菟丝子粗多糖抑制α-MSH诱导B16细胞的黑色素含量

黑色素含量增加会导致皮肤变深与色素沉着^[22]。采用α-MSH诱导B16细胞作为评价菟丝子粗多糖美白作用的细胞模型。在菟丝子粗多糖对B16细胞的安全浓度下，与对照组比较，α-MSH组B16细胞的黑色素含量明显增加，数值为153.33%（P < 0.001）；与α-MSH组比较，10、100 μg/mL的菟丝子粗多糖溶液可以显著降低黑色素含量（P < 0.05或P < 0.01）。见图 6。

2.8 菟丝子粗多糖抑制α-MSH诱导B16细胞的酪氨酸酶活性

酪氨酸酶是黑色素生成过程中的关键限速酶，考察药物对酪氨酸酶活性的影响是评价其是否具有美白功效的指标之一^[23-24]。实验结果显示，α-MSH组B16细胞酪氨酸酶活性为173.17%，与对照组比较显著增加（P < 0.001），1、10、100 μg/mL菟丝子粗多糖组的酪氨酸酶活性分别为150.85%、144.17%、133.06%，其中10、100 μg/mL的菟丝子粗多糖溶液能够明显降低酪氨酸酶活性（P < 0.05或P < 0.01）。见图 7。

3 讨论与结论

菟丝子作为一味种子类中药，具有基源较多、分布地广泛、资源丰富的特点^[25]，包含黄酮类、多糖类、酚酸类、木脂素类等多种化学成分与药理活性，开发潜力较大^[26]。祁小妮等^[27]采用响应面分析法优化了热水浸提菟丝子多糖的提取工艺，同时可以清除羟基自由基，具有一定抗氧化能力。叶春林等^[28]发现菟丝子多糖能够清除DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基，具有抗氧化活性。王前程^[29]采用酶解法获得菟丝子发酵多糖，发现其具有较好的蘑菇酪氨酸酶清除率和DPPH自由基清除活性，不同分子量菟丝子发酵多糖在低浓度（< 2 mg/mL）时表现出对B16细胞内酪氨酸酶活性的抑制作用，促使其黑色素生成含量减少。

本研究采用水提醇沉法制备得到的菟丝子粗多糖提取率为11.04%，多糖含量为56.03%，Mw为74 565 g/mol，主要由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成。进一步对菟丝子粗多糖进行体外抗氧化活性和美白功能研究，结果表明菟丝子粗多糖对DPPH自由基与ABTS⁺自由基均具有良好的清除能力，能够提高对293T细胞中ARE的转录活性，减少斑马鱼体内黑色素生成并降低B16细胞内黑色素含量、抑制酪氨酸酶活性，其较好的抗氧化能力、美白活性的发现为开发菟丝子在化妆品与保健品领域的应用提供了理论依据及新思路。