绝经综合征（MPS）指45~55岁女性所表现出的一系列生理与心理症状，如潮热、失眠和焦虑等^[1]。中医既往未见统一病名，称绝经前后诸症。在临床实践中，该病常依据其核心表现不同，分别归属于“年老血崩”“失眠”“心悸”等范畴进行辨证诊治。其核心病机在于“天癸竭”与“肾虚”，肾精亏虚进一步波及并影响其他脏腑，从而引发多种复杂症状^[2]。绝经期诸多症状的产生，其根本病机源于“天癸竭”与肾气衰亏。肾为先天之本，主司生殖，对女性生长发育至关重要。《素问· 上古天真论》明确指出，女子约至“七七”之年，由于任脉空虚、太冲脉衰败，天癸枯竭，月经终止而无法生育。任脉作为“阴脉之海”，主管精、血、津、液；冲脉为“十二经之海”和“五脏六腑之海”。肾虚精亏导致冲任两脉虚衰，阴血不足，从而引发符合“阴虚”特征的潮热、盗汗、烦躁、失眠等症状，验证了《格致余论》“阳常有余，阴常不足”的学术观点^[3]。在临床上，可以选取舌针穴位肝穴、肾穴等改善失眠及潮热盗汗症状^[4]。因此，在绝经期滋阴补血以养肾为关键治疗法则。

两地汤源于《傅青主女科》，由生地黄、玄参、白芍、麦冬、地骨皮、阿胶组成^[5]。本方以生地黄与地骨皮共为君药。玄参可以滋阴清热，麦冬则能泻热养阴、生津润燥，玄参、麦冬与生地黄相配，正合增液汤之组成。增液汤以大量滋阴生津之品为主，取其“增水行舟”之意；配伍地骨皮更能增强全方滋阴清热之效。方中另佐白芍以养血敛阴，阿胶以滋阴补血。诸药相合，全方侧重滋阴壮水，水充则火自敛，阴复则阳得固。清代医家傅山称此方“皆用滋水之品”，意在强调其专于补益阴液之功。古代医家多用于治疗月经先期，现代多用于治疗月经失调^[6]、崩漏及MPS^[7-9]，还可以治疗中老年女性阴道干涩^[10]。随着西医对两地汤组成中药研究的持续进展，在调节激素水平及改善免疫功能等方面的疗效已经获得科学验证。生地黄通过抗炎、抗氧化发挥抗抑郁作用，降低血压、血脂，保护肾脏^[11]。玄参在抗炎、抗氧化的同时还能够保护肝脏^[12]。白芍保肝、抗炎，同时对神经、心血管也具有保护作用，可以抑制白细胞介素-6（IL-6）/信号转导和转录激活因子3通路活化^[13]。麦冬可以减轻氧化应激引起的线粒体功能障碍，降低血脂水平、镇静催眠、增强免疫^[14]。地骨皮改善睡眠，通过清除超氧自由基延缓衰老^[15]。现代药理研究发现阿胶具有抗炎、调节免疫、纠正贫血作用，还可以抗衰老、抗疲劳、抗氧化^[16]。据此，本研究采用网络药理学结合动物实验的研究方法，旨在阐明两地汤治疗MPS的内在作用机制，以期为该方的临床应用提供理论依据。

1 材料 1.1 动物

纳入SPF级6~8周C57BL/6雌性小鼠，体质量（20±2）g，购自宁夏医科大学实验动物中心。实验通过宁夏医科大学实验动物伦理委员会审查（IACUC-NYLAC-2024-127）。

1.2 药品、试剂

生地黄30g（批号：T000204056）、地骨皮9g（批号：T440203924）、阿胶9g（批号：T121704169）、玄参30g（批号：T000204073）、白芍15g（批号：T001703958）、麦冬15g（批号：T441703928），购自宁夏大医中医医院门诊部中药房，将两地汤免煎颗粒剂研磨成粉末，用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液溶解，浓缩至低剂量0.300g/mL、中剂量0.588g/mL、高剂量1.173g/mL，-4℃保存。

4-乙烯基环己烯二环氧化物（VCD）购自上海易恩化学技术有限公司（批号：RH616091/R017685，25mL），0.2mL溶于10.74mL芝麻油中，配制成20mg/mL的VCD芝麻油溶液，在常温下保存即可。

芬吗通（雌二醇片/雌二醇地屈孕酮片，规格：1/10mg×28片，注册证号：H20150346），采购自宁夏古方汉方大药房有限公司胜利南街店。实验前将药片研磨粉碎，使用0.5%的CMC-Na溶液配制成所需制剂。

IL-6抗体、STAT3抗体、磷酸化STAT3（P-STAT3）抗体、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）抗体、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号分别为：26404-1-AP、10253-2- AP、28945-1-AP、19677-1-AP、26593-1-AP）；缺氧诱导因子-1（HIF-1）抗体（成都正能生物技术有限责任公司，批号：340462）。

1.3 仪器

组织石蜡包埋机（ArcadiaH+C，含冷冻台）、全自动组织脱水机（TP1020）、全自动轮转式石蜡切片机（RM2255）、烤片机（HI1210）、摊片机（HI1220）和切片扫描仪（APerioLV1）采购自德国Leica公司。以上设备用于制备免疫组织化学、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色所需石蜡切片及图像扫描。

2 方法 2.1 网络药理学分析两地汤治疗MPS机制 2.1.1 获取活性成分及靶点

对两地汤中6味中药的活性成分、靶点进行检索。由于生地黄、地骨皮、阿胶、玄参、白芍、麦冬不能全部在Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology（TCMSP）数据库中被检索到，但是为了保证得出数据格式统一、标准一致、可比性强，需要方中所有药物均在同一数据库中被检索到，而Herb数据库（http://herb. ac.cn）可以检索到两地汤中全部药物，所以采用Herb数据库进行检索。将检索出的化学成分采用Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获取对应的分子结构，并导入superpred数据库（https://prediction.charite.de/index.php），Probability> 60%，获取有效成分基因名称。

2.1.2 获取MPS疾病相关靶点

将“Menopausal Syndrome”作为关键词，在GeneCard数据库（https://www.genecards.org）、OMIM数据库（https://www.omim.org）、DrugBank数据库（https://go.drugbank.com）中检索相关靶点并剔除重复项。

2.1.3 两地汤治疗MPS的可能靶点及蛋白质-蛋白质相互作用网络图（PPI网络图）制作

将MPS疾病相关靶点与两地汤药物活性成分靶点用Venny2.1平台（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）绘制出韦恩图。将两地汤与MPS的共同靶点录入STRING数据库（https://cn.string-db.org），制作PPI网络图，并通过Cytoscape3.10.3软件获得“药物-活性成分-靶点”网络图。

2.1.4 基因本体（GO）功能注释与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

将Cytoscape3.10.3中得到的靶点导入DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov），得出生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）3项分析。选取出GO分析的前10项，KEGG通路与MPS相关通路20项（P < 0.01），并通过微生信平台得到关键通路及其核心蛋白的可视化图。

2.1.5 分子对接分析

选取关键信号通路中的蛋白因子作为分子对接受体，并将通过“药物-活性成分-靶点”筛选流程所得、兼具较高口服生物利用度与类药性的核心活性成分作为对接配体。从Uniprot数据库（http://www.uniprot.org）及PDB数据库（https://www.rcsb.org/）中获取关键靶点蛋白的三维结构文件（格式为.pdb）。活性成分的结构文件（格式为.sdf）则通过PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载。蛋白受体PDBID为IL-6：1ALU、STAT3：6NJS、HIF-1：8HE0、Caspase-3：1GFW、Bcl-2：1G5M。小分子配体CompoundCID为松柏苷（coniferin）：5280372、柳杉酚（sugiol）：94162、儿茶素（catechin）：9064、异前胡醚（isoimperatorin）：68081、马美辛（Marmesine）：334704、白当归醇（senbyakangelicol）：156995、金合欢素（acacetin）：5280442、醋酸橙黄胺（aurantiamideacetate）：10026486。小分子配体经Chem3D软件转换为“.mol2”格式，蛋白受体则使用PyMOL进行结构优化。后续分子对接利用AutoDockTools1.5.7软件和CB-Dock2平台（https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php）完成，在CB-Dock2平台进行自动盲坞，通常将结合能低于-5kcal/mol作为判断配体与受体间具有良好结合活性的阈值。

2.2 体内实验 2.2.1 分组、造模及给药

SPF级6~8周C57BL/6雌鼠分为空白组、模型组、芬吗通组、两地汤低剂量组、两地汤中剂量组、两地汤高剂量组，每组12只。除空白组外，其余各组分别用VCD以160mg/kg的小鼠剂量腹腔注射15d建立模型。通过前期预实验，发现小鼠体质量下降、动情周期紊乱、卵巢组织染色切片显示卵巢萎缩、卵泡减少，提示模型建立成功。

模型建立成功后进行灌胃治疗，空白组与模型组给予0.9%生理盐水0.3mL/d。芬吗通组21mg（/kg·d）。两地汤各剂量组按照设定剂量给药，低剂量为临床等效剂量1/2，中剂量为临床等效剂量，高剂量为中剂量2倍。每日1次，持续28d。

2.2.2 实验动物生物样本采集

给药干预完成后，待小鼠进入动情间期（人类月经期对应阶段）后取材。动情周期的确认以4~5d为间隔进行监测。摘取双侧卵巢，其中一侧迅速置于干冰上进行冷冻，随后转移至-80℃冰箱贮存；另一侧浸没于4%多聚甲醛溶液固定24h。

2.2.3 TUNEL染色观察小鼠卵巢颗粒细胞凋亡情况

切片经脱蜡与水化处理后，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗；随后进行蛋白酶K消化，再次以PBS清洗；接着实施通透处理，并重新使用PBS清洗；后加入TUNEL反应液孵育，反应完毕后再以PBS清洗；对细胞核进行复染，PBS清洗后完成封片，最后于荧光显微镜下观察。其中，绿色荧光标记指示凋亡阳性信号，蓝色荧光代表细胞核。

2.2.4 免疫组织化学法检测卵巢组织中IL-6、STAT3、HIF-1、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达

免疫组织化学法检测选取制备完成的卵巢组织石蜡切片，按照以下顺序进行操作：石蜡切片→脱蜡、水化→ PBS漂洗→抗原修复→3%过氧化氢（H2O2）室温10min→一抗孵育→PBS漂洗→二抗孵育→显色→复染细胞核→封片。棕色信号为蛋白表达，蓝色信号为细胞核。

2.2.5 统计学分析

统计学分析及图形生成分别采用SPSS27.0及GraphPadPrism9.5.0软件平台。计量资料采用均数±标准差（x±s）进行描述。多样本计量资料和分类变量的组间比较，依次采用单因素方差分析和卡方检验。若单因素方差分析结果显示差异具有统计学意义，则使用LSD-t检验实施两两比较。P < 0.05为差异具有统计学意义。

3 结果 3.1 网络药理学筛选结果 3.1.1 两地汤主要成分、作用靶点

采用Herb数据库筛选、收集得到生地黄16个、玄参50个、白芍109个、麦冬23个、地骨皮27个、阿胶2个有效成分。删除重复项，得到药物靶点453个。选用GeneCards、OMIM、DrugBank数据库分别获得500、647、78个与MPS相关靶点，删除重复项后共获得1155个与MPS相关的靶点。将两地汤药物靶点与疾病靶点取交集，得到两地汤治疗MPS的潜在靶点68个，韦恩图见图 1。采用Cytoscape3.10.3制作“药物-疾病”共同靶点网络图，见图 2。采用Cytoscape3.10.3制作PPI网络图。通常情况下，某个靶点在疾病网络中扮演的角色越关键、与其他靶点的相互作用越广泛，其对应的节点在图表中的颜色便会越深，面积也越大，见图 3。STAT3、EGFR、ESR1、ERBB2、mTOR为核心靶点。

3.1.2 药物-活性成分-靶点预测网络图

将“药物-活性成分-靶点”数据制作“network.xlsx”文件及“type.xlsx”文件，并导入Cytoscape3.10.3得到两地汤治疗MPS的“药物-活性成分-靶点”图，见图 4。

3.1.3 GO分析及KEGG通路富集分析

将68个药物-疾病共同作用靶点提交至DAVID数据库，分别开展GO功能注释与KEGG通路富集分析（显著性阈值设置为P < 0.01），并从BP、CC、MF中分别选取富集显著性排名前10位的条目进行后续分析。结果显示BP涉及信号传导、磷酸化、RNA聚合酶对转录的正向调节Ⅱ等；CC涉及血浆膜、细胞质、核质等；MF涉及蛋白质结合、ATP结合、相同蛋白质结合等，见图 5。通过DAVID数据库共富集得到115条与两地汤治疗MPS相关通路，根据P < 0.01筛选出两地汤与MPS治疗相关的前20条通路。KEGG主要与癌症途径、HIF-1信号通路、ErbB信号通路、内分泌抵抗等有关，见图 6。文献表明，衰老与氧化应激状态相关，由此推测，氧化应激途径可能是两地汤治疗MPS的关键通路，见图 7。

3.1.4 分子对接分析结果

将关键通路的上的蛋白因子IL-6、STAT3、HIF-1、Caspase-3、Bcl-2作为分子对接受体，“药物-活性成分-靶点”筛选出的口服生物利用度及类药性高的关键活性成分作为分子对接配体，其中包含生地黄中的松柏苷、玄参和地骨皮中的柳杉酚、白芍中的儿茶素、异前胡醚、马美辛、白当归醇、地骨皮中的金合欢素、醋酸橙黄胺。将受体与配体一一对接，结合能均 < -5kcal/mol（表 1），表明两地汤主要药物成分与IL-6、STAT3、HIF-1、Caspase-3、Bcl-2这5个核心蛋白结合稳定，其中STAT3与柳杉酚结合最强，结合能为-8.3kcal/mol，自动盲坞得到中心位点（16，11，18），对接尺寸（20，20，20），见图 8。对接图中黄色虚线代表配体与受体作用键（2.5、2.1为作用键距离），粉色实线代表氨基酸残基结合位点（LYS-370、THR-440为位点号）。

3.2 两地汤治疗MPS实验结果 3.2.1 两地汤对MPS小鼠卵巢组织中IL-6、STAT3、HIF-1、Caspase-3、Bcl-2蛋白的影响

结果显示，与空白组比较，模型组小鼠卵巢组织内IL-6、STAT3、HIF-1、Caspase-3表达均上调（P < 0.0001），而Bcl-2蛋白表达下降（P < 0.0001）。在给予不同剂量两地汤干预后，与模型组比较，各给药组（低、中、高剂量）中IL-6、STAT3、HIF-1表达均出现下降（P < 0.05）。与模型组比较，两地汤中、高剂量组卵巢组织中Caspase-3蛋白表达降低（P < 0.001）；与模型组比较，两地汤低、中、高组卵巢组织中Bcl-2蛋白表达升高（P < 0.05）。见图 9、10、11、12、13。

3.2.2 两地汤对MPS小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响T

UNEL染色结果显示，绿色信号为阳性信号，与空白组比较，模型组小鼠卵巢颗粒细胞大量凋亡（P < 0.0001）；与模型组比较，各治疗组凋亡数量均见减少（P < 0.0001）。见图 14、表 2。

4 讨论

卵巢功能逐步减退会引发体内雌激素水平发生波动并日趋下降，这一变化是导致女性出现一系列身心不适症状的核心原因^[17]。性激素与中枢神经递质水平的共同波动，通过影响神经内分泌系统，最终引发多种生理与心理变化及不适感^[18]。绝经期的本质是卵巢功能衰竭，而非简单的月经终止。在此过程中，由于卵巢衰退引发的雌激素水平波动性下降成为了关键诱因，它促使内分泌、心血管和神经系统等功能障碍显现或加剧^[19]。因此，卵巢衰老被公认为女性衰老历程中的核心节点之一。

随着年龄增长，体内线粒体功能衰退^[20]、抗氧化防御能力减弱等均会造成活性氧（ROS）堆积。ROS持续上调是细胞氧化应激的主要特征，也是导致细胞衰老的重要因素^[21]。研究表明，氧化应激损伤是卵巢功能衰退的关键因素，卵巢中ROS的过度积累会加速卵巢细胞衰老，炎症反应导致卵泡质量下降与卵泡数量减少，从而降低卵巢功能^[22-24]。IL-6通过STAT3上调HIF-1，在慢性炎症或氧化应激环境中，IL-6结合受体gp130激活Janus激酶（JAK），进而将STAT3磷酸化。活化STAT3进入细胞核后直接结合HIF-1基因启动，促进HIF-1转录^[25-26]。STAT3还通过诱导雌激素相关受体α（ERRα）表达，ERRα与HIF-1蛋白结合并阻止其降解，进一步增加HIF-1的稳定性^[25]，同时通过激活自噬相关蛋白Bcl-2触发自噬依赖性衰老^[26]。Bcl-2高表达可以抑制线粒体外膜透化，阻断细胞色素c释放，从而抑制Caspase-3激活^[27]。相反，当Bcl-2表达较低时，细胞色素c释放到细胞质中，与凋亡蛋白活性因子-1（Apaf-1）等蛋白形成“凋亡体”，Caspase-3被激活^[28]。绝经后女性雌激素水平下降，雌激素受体（ESR1）信号减弱，失去对HIF-1的抑制作用，慢性缺氧微环境加速进一步加重衰老（如骨质疏松、血管老化）。结合网络药理学分析结果，推测MPS的发生可能是ROS积累导致衰老细胞积聚，IL-6参与细胞衰老，由衰老细胞产生，并参与衰老诱导的炎症^[29]，进而激活STAT3，使得HIF-1稳定，释放缺氧因子，导致线粒体功能障碍加剧，并调控下游基因，诱发凋亡，使抗凋亡因子Bcl-2失去抗凋亡功能。IL-6/STAT3虽然不直接参与氧化应激，但是其在HIF-1信号通路中可以激活HIF-1，加剧氧化应激反应。研究表明，给予MPS模型小鼠两地汤灌胃治疗后，IL-6、STAT3、HIF-1、Caspase-3蛋白表达较模型组降低，Bcl-2蛋白表达较模型组升高，最终抑制了小鼠卵巢颗粒细胞凋亡状态。

此外，本研究基于既往临床治疗MPS有效性的基础上开展了分子机制研究，旨在进一步补充两地汤治疗MPS的有效依据。受工作量及研究人员精力影响，此次研究仅完成了体内动物实验，而两地汤治疗MPS卵巢衰老的体外细胞实验尚待完成，以期进行体内外双向验证更加全面地探索两地汤的药理机制。

综上所述，两地汤可以降低小鼠卵巢中IL-6、STAT3、HIF-1、Caspase-3蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达，改善卵巢组织炎症性老化状态，HIF-1信号通路可能是两地汤治疗MPS的关键通路，涉及IL-6、STAT3、HIF-1、Caspase-3、Bcl-2等关键蛋白。