随着中药的广泛使用，常有中药不良反应事件发生，尤其是中药肝损伤事件引起了世界范围内人们的广泛关注^[1]，因此重视中药的肝毒性，研究其肝损伤成分及作用机制仍是亟待解决的问题。补骨脂乙素（Isobavachalcone，IBC）是从补骨脂中提取的香豆素类化合物，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等多种药理作用^[2]。在补骨脂中的含量为0.86~6.86 mg/g，仅次于补骨脂素和补骨脂酚，且与药典中补骨脂的指标性成分补骨脂素（1.08~6.95 mg/g）和异补骨脂素（0.76~5.01 mg/g）较接近^[3]。因此，本研究采取代谢组学探究补骨脂乙素对人源肝细胞系HepaRG细胞（human hepatoma-derived progenitor cells）的代谢影响，为在临床使用补骨脂预防其产生的毒性提供一定的实验依据。

1 材料与方法 1.1 细胞来源

HepaRG细胞购自上海冠导生物工程有限公司。

1.2 主要试剂

补骨脂乙素（纯度≥98%）购自成都格利普生物科技有限公司。

1.3 仪器

TripleTOF^TM5600-system高分辨质谱（AB SCIEX，美国）；ExionLC^TM AC超高效液相色谱仪（AB SCIEX，美国）；高速离心机（Thermo，美国；离心半径R=10 cm）；SPARK多功能酶标仪（TECAN，瑞士）。

1.4 细胞培养及分组

在37 ℃、5% 二氧化碳的恒温恒湿培养箱中，将HepaRG细胞在含有10% 胎牛血清的1640培养基中培养。取对数生长期的HepaRG细胞以8×10⁴ cell/mL接种在96孔板中分为对照组和给药组（5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 µmol/L），处理24 h后，吸取细胞上清用于代谢组学检测，细胞用于MTT细胞增殖检测。

1.5 MTT法检测

待测的96孔板中每孔加入总浓度为0.5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃孵育4 h后，弃去上清，加入二甲基亚砜，100 µL/孔，待甲瓒完全溶解后，使用酶标仪检测570 nm波长处的吸光度值。

1.6 代谢组学分析 1.6.1 细胞上清前处理

取出冻存于-80 ℃冰箱的细胞上清样本于室温解冻后，1.5 mL离心管中加入300 µL上清和1 mL乙腈，涡旋3 min，于4 ℃低温离心10 min，8 000 r/min，吸取1 mL上层清液至真空浓缩离心机下浓缩挥干，加100 µL 50% 乙腈复溶，涡旋混匀3 min，4 ℃下14 000 r/min离心10 min，吸取80 µL上层清液，4 ℃下14 000 r/min二次离心10 min，吸取60 µL上清液用于质谱检测。

1.6.2 色谱条件

Shim-pack GISSC18色谱柱（2.1×100 mm，1.9 µm），柱温为40 ℃，进样量为5 µL，流速为0.2 mL/min。流动相为0.1% 甲酸水（A）和0.1% 甲酸乙腈（B）。梯度洗脱条件为0~1 min，5% B；1~15 min，5%~95% B；15~17 min，95% B；17~ 17.1 min，95%~5% B；17.1~20 min，5% B；整个进样过程样品置于4 ℃自动进样器中。

1.6.3 质谱条件

采用电喷雾电离源（ESI源），在正、负离子电离模式下进行质谱检测分析。设置分子量扫描范围为100~1 500 m/z；喷雾电压为5 500 V；离子源温度550 ℃；气帘气35 Psi；去簇电压为80V/-80V；碰撞能量10/-10 eV^[4]。本实验运用Triple TOF^TM5600系统（AB SCIEX ExionLC^TM AC，美国）进行代谢组学分析。

1.6.4 代谢组学数据处理与多元统计分析

采用MS-DIAL分析软件对进行峰对齐、解卷积、峰提取等处理，并对代谢物峰面积进行总峰面积归一化处理。将得到的数据导入SIMCA-P 14.1软件进行多元统计分析，包括主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）等。

1.6.5 差异代谢物及代谢通路分析

根据变量重要性投影（VIP）>1和t检验（P < 0.05）作为组间差异代谢物筛选的受限条件寻找差异代谢物，在人类代谢组数据库（HMDB）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库中检索确定差异代谢物。运用MetaboAnalyst（http://metpa.metabolomics.ca）对其进行通路富集分析，筛选相关代谢通路。

1.7 统计分析

采用Graphpad Prism 8.0进行统计学分析，实验结果均采用均数±标准差（x±s）来表示。采用单因素方差分析进行多组间差异比较，使用Tukey进行多重比较校正。P < 0.05表示具有显著性差异。

2 结果 2.1 MTT法检测细胞增殖情况

细胞培养24 h后，采用MTT法检测细胞增殖活性。随着IBC剂量的升高，HepaRG的细胞活力显著降低。30 µmol/L时表现出较为明显的细胞毒性；与对照组相比，当给药浓度达到24.53 µmol/L时，细胞活力降低10%；在41.22 µmol/L时，细胞活力降低90%（图 1，a）。通过计算，得出其IC₅₀为32.89 µmol/L（图 1，b），表明IBC对HepaRG肝细胞有较强的细胞毒性作用。为直观展示IBC对HepaRG细胞的影响，选取4个具有代表性的浓度（对照组、无明显毒性剂量组-15 µmol/L、接近半数抑制浓度组-30 µmol/L、高毒性剂量组-45 µmol/L）在Incucyte下实时观察。结果表明，细胞形态学观察与MTT检测结果呈现一致性，对照组及低浓度组HepaRG细胞维持典型的肝细胞特征，呈多角形或短梭形，胞体紧密贴切核质比均衡，而中浓度和高浓度组则出现贴壁能力减弱、细胞变圆模糊等现象，值得注意的是，中浓度组开始出现了气泡状小泡，且随浓度升高逐渐增多。进一步验证了IBC对细胞增殖的抑制作用。

2.2 代谢组学分析

基于IBC对HepaRG细胞活力的剂量依赖性抑制效应，本研究选取对照组、低浓度组（15 µmol/L）、中浓度组（30 µmol/L）、高浓度组（45 µmol/L）的细胞上清进行代谢组学分析，以揭示IBC的动态代谢过程：从低浓度亚毒性效应、中浓度代谢稳态失衡至高浓度不可逆毒性效应，同时通过对照组排除背景干扰。

2.2.1 代谢轮廓分析

对对照组、3种给药组进行PCA代谢轮廓分析，如图 2。在PCA图中对照组和给药组样本之间观察到明显的分离趋势，表明在IBC作用下HepaRG细胞的代谢产物表达呈差异性代谢特征。随IBC浓度升高，高浓度组产生显著偏移，对照组与低、中、高浓度给药组比较，通过PCA得分图说明不同组别在图中呈现出分离状态，表明IBC使HepaRG细胞的代谢产生了变化。该结果与细胞活力检测结果变化呈相似趋势。

2.2.2 细胞上清OPLS-DA分析

为了进一步分析不同组之间的差异关系，更好地对模型解释，采用监督性的正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）方法，使用置换检验（n=200）对模型进行过拟合分析，分别对低、中、高3个给药组和对照组之间进行模型分析，以筛选潜在差异代谢物。OPLS-DA分析显示，低、中、高3种给药组与对照组在OPLS-DA上能完全分离，提示组间代谢差异明显（如图 3，4）。

2.2.3 差异代谢物分析

当OPLS-DA统计分析得到的VIP值>1以及t检验P < 0.05时，认为代谢物差异具有统计学意义。低浓度组与对照组比较，差异代谢物有21个；中浓度组与对照组比较，差异代谢物有29个；高浓度组与对照组比较，差异代谢物有31个（见图 5）。各组差异代谢物主要为氨基酸类、有机酸类、脂类、维生素类等。这些差异代谢物在不同给药组间区分明显，组内聚类理想，说明IBC诱导后能够引起HepaRG细胞代谢轮廓的变化。与对照组相比，聚类分析后3种给药组细胞代谢物水平均发生了显著的变化。组氨酸、亚油酸、邻苯二甲酸单酯、N-琥珀酰-L-精氨酸随着给药浓度升高，呈现显著下调的趋势；氨酰胺、赖氨酸、磷酸胆碱、吡哆醇、5-脲基-4-咪唑羧酸酯、黄嘌呤等呈显著上调趋势。不同的是，苯丙氨酸在低、中浓度下显著上调而在高浓度下显著下调（见图 6）。

2.2.4 代谢通路分析

分别将上述筛选的各组差异代谢物结合MetaboAnalyst 5.0对代谢通路进行富集与分析。以P < 0.05为临界值，筛选认为其具有显著性水平的代谢富集通路，主要富集氨基酸类代谢、脂质代谢、维生素代谢等，其中氨基酸类合成途径较为显著（见图 7）。在低、中、高3种不同浓度给药组，均显著富到苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途径；随着给药浓度的升高，精氨酸生物合成途径富集程度逐渐降低，而缬氨酸、亮氨酸生物合成途径富集程度逐渐升高。

3 讨论

补骨脂作为传统补益类中药，拥有悠久的用药历史和明确的临床疗效，具有温肾助阳、温脾止泻等功效，主治肾阳不足、阳痿遗精、腰膝冷痛等^[5-6]。但对其毒性记载较少，最早见于《雷公炮制论》中：“性本大燥，毒”。现代药理学研究对补骨脂中致肝毒性的各成分进行物质基础研究，主要集中于新补骨脂异黄酮、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚等^[7-8]，而目前对于补骨脂乙素的肝毒性作用研究较少。基于此，本研究采用通过非靶向代谢组学途径，系统筛选补骨脂乙素致肝损伤的潜在代谢标志物，以期为该成分的毒性机制研究提供科学依据。

代谢组学作为系统生物学的重要分支，凭借代谢组学对内源性和外源性的动态代谢变化提供了全面的信息，为解析药物性肝损伤的分子机制提供独特视角^[9]。可鉴定及筛选药物引起肝损伤的生物标志物，在药物暴露早期识别代谢稳态失衡信号，反映从亚损伤到严重损伤的代谢变化，从而有效预防肝损伤风险^[10]。

本研究以HepaRG细胞外培养液为分析对象。与常规动物血清、组织匀浆样本相比，细胞外培养液中的代谢物直接源于细胞与药物相互作用及分泌活动，规避了动物样本中多器官协同代谢、微生物共代谢等复杂背景干扰；药物诱导的早期代谢响应在细胞外液中更易富集检测，而动物体内稳态环境可能弱化低剂量效应。

本研究在30 µmol/L浓度的IBC作用下，HepaRG细胞活性开始显著降低，细胞死亡率升高，表明IBC对HepaRG具有确切的毒性作用。肝脏是代谢氨基酸的重要器官，对氨基酸代谢具有重要作用，肝细胞损伤会引起氨基酸代谢紊乱^[11-12]。进一步通过非靶向代谢组学验证，富集结果显示，苯丙氨酸生物合成途径则在低、中、高全浓度梯度下均显现显著富集效应，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径的富集效应集中显现在中、高浓度区间，精氨酸生物合成途径在低、中浓度处理组呈现显著富集特征。

亚太肝病学会共识指南指出，药物可能通过干扰氨基酸代谢通路诱发肝损伤。已有研究表明，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸可能与肝衰竭、非酒精性脂肪肝、肝性脑病等发病机制有关^[13]。研究发现，苯丙氨酸等芳香族氨基酸对人乳腺癌细胞系具有显著的抑制作用，且早期研究对于苯丙氨酸代谢检测发现具有肝损伤的患者中，苯丙氨酸代谢速率与肝损伤严重程度有关，其下调可能反映肝细胞功能障碍^[14-15]。因此苯丙氨酸作为必需氨基酸，当肝细胞受损时，影响苯丙氨酸代谢失衡，导致整体水平的下降。虽然低浓度组在MTT检测结果中发现并未引起细胞活力的影响，考虑其可作为早期细胞毒性筛选的潜在指标，是IBC对HepaRG细胞损伤的关键代谢途径之一。

缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸为支链氨基酸（BCAA），能够参与蛋白质代谢和各种生理代谢功能，为机体提供能量，且有研究发现通过诱导BCAA水平升高可加重肝损伤^[16-17]。在中、高浓度下，亮氨酸、异亮氨酸上调，因此考虑缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成可能是IBC诱导HepaRG细胞发生严重肝损伤的关键代谢通路之一。

精氨酸属于非必需氨基酸，在肝脏保护中发挥着重要作用，可以缓解肝脏炎症和损伤等情况^[18-19]。一定程度上通过精氨酸合成途径缓解IBC诱导的肝细胞损伤，适度的精氨酸上调可能是细胞对抗毒性损伤的自我保护机制，当损伤程度超过细胞代偿能力时，单纯依赖精氨酸生物合成可能不足以维持肝细胞功能。除此之外，在差异代谢物分析中发现，组氨酸在各浓度显著下调。组氨酸作为一种无法自行合成的必需氨基酸，在生物体内具有多重生理功能。研究发现组氨酸代谢下调是肝缺血再灌注损伤中的共有特征，组氨酸代谢通路下调与肝炎症和氧化应激相关，且补充组氨酸后损伤得到改善^[20-21]。

综上所述，IBC诱导HepaRG细胞毒性的潜在机制可能涉及氨基酸代谢紊乱，主要通过以下代谢通路调控：通过抑制苯丙氨酸生物合成通路，同时激活缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸合成途径。值得注意的是，虽然精氨酸生物合成相关通路呈现上调趋势，但在高浓度暴露条件下其代谢产物并未出现显著累积现象。代谢途径与肝损伤的关联涉及多机制交叉，后续还需通过酶活性检测、功能实验等进一步验证以上代谢通路的具体调控作用，为全面深入探究补骨脂乙素致肝损伤的作用机制提供了理论依据。