2026, Vol. 45文章信息
- 白霞, 张冠宇, 武帅, 张永强, 张莉, 杨丹凤, 李曦
- BAI Xia, ZHANG Guanyu, WU Shuai, ZHANG Yongqiang, ZHANG Li, YANG Danfeng, LI Xi
- 欧前胡素通过AMPK/SIRT1/PGC-1α通路促白色脂肪棕色化
- Imperatorin promotes the browning of white fat through the AMPK/SIRT1/PGC-1α pathway
- 天津中医药大学学报, 2026, 45(2): 167-179
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2026, 45(2): 167-179
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2026.02.07
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文章历史
收稿日期: 2025-11-20
引用本文 |
2. 军事科学院军事医学研究院, 北京 300050
2. Military Medical Sciences Academy, Tianjin 300050, China
寒冷环境可导致低体温症、冻疮、冻伤等冷损伤，严重时可导致截肢、休克，威胁生命安全[1]。脂肪组织在维持能量稳态和适应低温环境中发挥核心作用，分为棕色脂肪（brown adipose tissue，BAT）、白色脂肪（white adipose tissue，WAT）和米色脂肪（beige adipocytes）。机体接受冷刺激或者药物干预时，主要通过激活棕色脂肪和米色脂肪从而增加机体产热[2-3]。棕色脂肪是一种特异性脂肪组织，主要功能是促进产热，可快速响应外界刺激，富含的大量线粒体通过氧化磷酸化合成解偶联，增加产热基因解偶联蛋白1（Uncoupling protein 1，Ucp1）的表达，介导适应性产热[4]。但BAT在人体中含量很少，仅占体质量的2%，主要分布在颈部、锁骨、肾脏周围，保护关键脏器，因此研究价值有限[5]。白色脂肪含量多，占体质量的40%~50%且分布广泛，主要功能是储存三酰甘油，没有线粒体。但白色脂肪具有Ucp1表达被诱导的能力，受到刺激后，氧化磷酸化效率增加，线粒体数量增多，机体产生非颤抖性产热，使白色脂肪转化为米色脂肪，又叫白色脂肪棕色化，改变脂肪功能从能量储存到能量消耗，对于维持体温稳定、抵御寒冷环境具有重要意义[6-7]。
近年来，中医理论常用于机体产热的中药有肉桂、白术、芍药[8-10]。中药促白色脂肪棕色化已成为抗寒研究中的一个热点领域，其在调节能量代谢和防治代谢性疾病方面的潜力吸引了众多研究者的兴趣[11]。但产热中药的活性成分和作用机制不明确。由于中药具有多成分、多靶点、多途径的特点，寻找有效单体促进白色脂肪产热至关重要。本研究基于网络药理学筛选活性单体并进行机制探讨。
欧前胡素（Imperatorin，IMP）是一种天然呋喃香豆素类化合物，广泛存在于伞形科植物当归、白芷等中药中。当归中的IMP具有抗抑郁、抗癌、抗氧化、降血压的药理作用[12-14]，白芷中的IMP具有抗菌、抗炎、抗心血管疾病、抗线粒体损伤等药理作用[15-18]。近年来有学者发现呋喃香豆素是瞬时受体电位香草醛亚家族1（Transient receptor potential vanilloid-1，TRPV1）微弱激动剂[19]，而TRPV1是重要的温度感受器，是多种止痛产热药物中的质量控制标准之一，基于这一理论我们可以推测IMP可调控机体生热。研究表明氧化代谢是欧前胡素的作用途径之一，而AMPK/SIRT1/PGC-1α是参与机体能量代谢、促进产热的典型途径，可促进底物磷酸化影响细胞生长、脂质代谢和线粒体功能，实现能量代谢重塑[20-21]。目前尚无研究证明欧前胡素能够调控AMPK/SIRT1/PGC-1α通路促进白色脂肪棕色化，本文以药物模拟冷暴露为主，观察体内外实验中棕色化相关蛋白表达的变化，探讨欧前胡素调控白色脂肪自主产热的作用机制。
1 材料与方法 1.1 细胞株与动物3T3-L1前脂肪细胞株购自中国科学院上海细胞库（目录号：GNM25）。
C57BL/6J小鼠76只购自北京维通利华公司（许可证为SCXK（京）2021-0006）。本次实验在动物伦理委员会的批准下进行（批准号：IACVC of AMMS-0402024-002），涉及的动物操作均符合动物伦理要求。
1.2 试剂与药物α-松油醇（货号HY-N5142）、胡黄连苷Ⅰ（货号HY-N0407）、松脂醇二葡萄糖苷（货号HY-N0657）、异鼠李素-3-O-新橙皮苷（货号HY-N0778）、欧前胡素（货号HY - N0285，纯度98%）、多索吗啡（货号HY-13418A）、吲哚美辛（货号HY-14397）购自美国MedChemexpress生物科技公司。DMEM高糖培养基（货号C11995500BT）购自美国Gibco公司；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤IBMX购自PROGEN Glpbio公司、地塞米松Dex（货号D4902）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤T3（货号I7018）均购自美国Selleck生物科技有限公司、胰岛素、油红O染液（240006007）购自北京索莱宝科技有限公司；CCK8试剂盒（货号BS350B）购自北京兰杰柯科技有限公司；PrimeScriptTM RT Master Mix购自日本TaKaRa公司；UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒购自生工生物工程股份有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京Solarbio）；兔源UCP1抗体（货号ab10983）购自英国Abcam公司、兔源PGC-1α抗体（货号1053-1002）购自Novus公司，兔源Prdm16（货号PA5-20872）购自Invitvogen公司；兔源Sirt1（货号94757）、兔源AMPK（货号2532S）、P-AMPK（货号2535T）购自美国CST公司；鼠源Tubulin（货号66031-1-Ig）、兔抗HRP标记二抗（货号SA00001-2）、鼠抗HRP标记二抗（货号SA00001-1）均购自Proteintech公司；甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、LDL-C（低密度脂蛋白胆固醇）、HDL-C（高密度脂蛋白胆固醇）检测试剂盒均购自南京建成生物研究所。
1.3 仪器台式高速冷冻离心机（德国艾本德公司）、PCR热循环仪、（Quant Studio5）实时荧光定量PCR仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）、涡旋仪（大龙兴创实验仪器股份公司）、电泳仪、Mini型转膜槽、平板摇床（北京六一仪器厂）、垂直电泳槽（美国Bio-Rad公司）、DM4B正置显微镜（Leica，Germany）、Amersham Imager680凝胶成像仪（Amersham Pharmacia Biotech，USA）。
2 方法 2.1 基于网络药理学促白色脂肪棕色化的药物预测 2.1.1 GEO芯片数据收集与处理打开GEO数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov），使用以下关键词：“adipose tissue、cold”，选中Mus musculus，筛选到数据集GSE13432（Larsson O等人，2009）。用GEO2R筛选出C57/BL6雄性小鼠4℃冷暴露一周和五周时白色脂肪组织中的差异基因，详细信息见表 1。
| 数据集 | 平台 | 分组 | 例数 | 性别 | 周龄 | 动物 |
| GSE13432 | GPL1261 | 1周4℃冷暴露 | 3 | 雄 | 6~8周 | C57/BL6 |
| 1周30℃ | 3 | 雄 | 6~8周 | C57/BL6 | ||
| GSE13432 | GPL1261 | 5周4℃冷暴露 | 3 | 雄 | 6~8周 | C57/BL6 |
| 5周30℃ | 3 | 雄 | 6~8周 | C57/BL6 |
识别共表达DEGs所涉及的主要代谢通路和信号传导途径。将1周与5周冷暴露上调与下调的基因导入Metascape网页进行GO富集与KEGG通路富集分析。
2.1.3 蛋白质互作图谱构建与核心基因的筛选将交集差异基因导入STRING，设置高信置度0.4，隐藏无链接的单个节点。将PPI筛选出的基因导入Cytoscape（3.9.1版），利用CytoNCA包选择度中心值（degree）中位值至最大值之间，筛选出hub基因。
2.1.4 基于ITCM数据库筛选中药成分打开ITCM数据库（http://itcm.biotcm.net），选择TCM - Query，Meheods选择SS-CMAP，GnenSet选择DEGs，分别输入Hub上调与下调基因，Show Top N Samples In Result输入N=10，点击提交，得出10个基于差异基因排名靠前的中药成分。
2.1.5 细胞实验筛选中药单体给予10 µmol/L不同药物干预3T3-L1前脂肪细胞棕色化，实时荧光定量PCR。
2.2 中药单体的生物活性评价 2.2.1 3T3-L1前脂肪细胞棕色化诱导将3T3-L1前脂肪细胞接种于6孔板中，待其生长至接触状态（即达到80% 融合）后（第0天），吸弃孔中液体，加入2 mL诱导培养基Ⅰ（含2 µg/mL胰岛素、1 µmol/LDex、0.5 mmol/L IBMX、1 nm/LT3、125 nm/L吲哚美辛的DMEM高糖培养基），继续培养48 h（第3天），吸弃孔中液体，加入2 mL诱导培养基Ⅱ（含2 µg/mL胰岛素、1 nm/L T3的DMEM高糖培养基），继续培养5 d，每隔2 d更换培养液，直至超过85% 的细胞分化为成熟脂肪细胞（大量脂滴形成），即可进行后续实验。
2.2.2 C57BL/6小鼠分组处理将8周龄雄性小鼠饲养于SPF级标准条件下自适应一周，自由获取水和食物。9周龄时，48只小鼠随机分成4组，一组12只，分别为对照组（Con）、低剂量组（15 mg/kg）、高剂量组（30 mg/kg）和2周冷暴露组（2W-CE），Con、2W-CE每日灌胃羧甲基纤维素钠溶液（CMC-Na），给药组每日灌胃欧前胡素药液，灌胃28 d，从第16天起2W-CE置于4 ℃冷舱至实验结束。每4 d测量一次体质量。实验小鼠给药结束后用异氟烷麻醉，眼眶取血，取腹股沟白色脂肪（iWAT），置于-80 ℃保存。
28只小鼠，每组7只，分组与上相同，用于生存实验。生存实验：灌胃28 d后，将对照组和给药组动物置于-15 ℃进行冷暴露，直至所有动物死亡，记录死亡时间。
2.2.3 CCK-8法检测细胞增殖活性将3T3-L1细胞接种至96孔板中，8×103个/孔，分为7组，每组6个复孔。置于细胞培养箱孵育24 h，向7组分别加入不同浓度的欧前胡素培养基，使7组终浓度分别为0、1、3、10、30、100、300 µmol/L。孵育48 h，加入CCK-8溶液，10 µL/孔，继续孵育2 h。孵育结束后，酶标仪测定培养板中细胞450 nm处吸光度A，并计算细胞存活率。
细胞存活率=（A药物组-A溶剂孔）/（A空白组-A溶剂孔）×100%。
2.2.4 油红O染色法鉴定成熟脂肪细胞取“2.2.1”项下培养的成熟脂肪细胞，吸弃孔中液体，PBS洗3次，每孔加入2 mL 10%多聚甲醛，室温固定30 min，吸弃孔中液体，PBS洗3次，加ORO fixative置摇床20 min，吸弃液体，水洗2次，加60%异丙醇静置5 min，吸弃后加入ORO Stain置摇床10 min，吸弃水洗5遍至无色，Mayer Hematoxulin复染2 min，水洗5次，加ORO Buffer 1 min后弃掉，加纯水置显微镜观察。
2.2.5 免疫荧光观察线粒体UCP1蛋白表达将3T3-L1前脂肪细胞按照3×104个/孔接种至12孔板，分为对照组和欧前胡素10 µm/L组，诱导棕色化成脂。将动物iWAT石蜡包埋并切片。将细胞和组织与UCP1抗体在4 ℃下孵育过夜。用PBS洗涤3次后，将合适的荧光标记的羊抗小鼠和羊抗兔抗体在室温下孵育1 h，根据标准方案用UCP1抗体进行免疫组织化学染色。显色后，在光学显微镜下观察组织中的UCP1表达，并通过Image Pro Plus 6.0软件计算阳性细胞值。
2.2.6 实时荧光定量RT-PCR测定脂肪棕色化基因的表达Trizol法提取3T3-L1细胞及iWAT的RNA并反转录成cDNA，进行实时荧光定量PCR扩增。测定棕色化相关基因的表达，包括脂肪产热基因Ucp1、含PR结构域的蛋白16（PR domain-containing 16，Prdm16）、过氧化物酶体增殖激活受体辅激活因子1α（Peroxisomal proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，Pgc-1α），脂质合成基因过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ，Pparγ）、CCAAT/增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein，C/EBP），米色特异性基因细胞死亡诱导DFFA样效应物A（Cell Death Inducing DFFA-Like Effector A，Cidea）、Cbp/p300与富Glu/Asp的羧基末端结构域1相互作用的反式激活因子（Cbp/p300 Interacting Transactivator with Glu/Asp Rich Carboxy-Terminal Domain 1，Cited1）、肿瘤坏死因子受体超家族成员9（4-1BB，TNFRSF9，Cd137）、碘甲状腺原氨酸脱碘酶2（Iodothyronine Deiodinase 2，Dio2）等。
各基因引物由引物设计软件Primer 5设计。以36B4为内参基因，各基因引物序列见表 2。
| 基因 | 引物序列 |
| Ucp1 | F：TCAGGATTGGCCTCTACGAC |
| R：CTGTAGGCTGCCCAATGAAC | |
| Prdm16 | F：CTGTTAGCTTTGGAGCCGAC |
| R：CAACCAAGCATCCAGTGAGC | |
| Pparγ | F：ATTGAGTGCCGAGTCTGTGG |
| R：GGCATTGTGAGACATCCCCA | |
| Pparα | F：AGAGCCCCATCTGTCCTCTC |
| R：ACTGGTAGTCTGCAAAACCAAA | |
| PGC-1α | F：AGTGGTGTAGCGACCAATCG |
| R：GGGCAATCCGTCTTCATCCA | |
| C/EBP | F：GCCAAGAAGTCGGTGGACA |
| R：GTCTCCACGTTGCGTTGTTT | |
| Dio2 | F：AACAGCTTCCTCCTAGATGCC |
| R：TCTGCACTGGCAAAGTCAAG | |
| Cidea | F：CAGCTCGCCCTTTTCGAGTT |
| R：ACTACCCGGTGTCCATTTCTG | |
| Cited1 | F：ATGCCAACTATGTCGAGGCC |
| R：CAAACTCATTCTGCCCCAGC | |
| Tmem26 | F：CCATGGAAACCAGTATTGCAGC |
| R：ATTGGTGGCTCTGTGGGATG | |
| Nrf1 | F：CAGGAGATGCAACAGGGAGC |
| R：ATGAACTCCATCTGGGCCAT | |
| Tfam | F：CGGCAGAAACGCCTAAAGAAG |
| R：GCTTCAATTTCCCCTGAGCTG | |
| 36b4 | F：CTGCACTCTCGCTTTCTGGA |
| R：ACGCGCTTGTACCCATTGAT | |
| Opa1 | F：GGCCCTTCTCTTGTTAGGTTCA |
| R：TGAGCTTCCTGTGGTGGATG |
细胞与组织加入RIPA裂解液收集放入离心管中，12 000 r/min离心10 min（离心半径Rmax：14.8 cm）。离心结束后，取上清，进行BCA定量测定浓度，加5×Loading Buffer 95 ℃煮10 min，向加样孔中加入处理好的蛋白样品和Marker。SDSPAGE凝胶电泳恒压150 V电泳至Marker完全分离。目的条带转至PVDF膜上，电转时电压100 V，时间55 min。转膜后取出PVDF膜放入含有5% 脱脂牛奶封闭液封闭2 h。孵育一抗（1∶1 000），4 ℃过夜。接着孵育二抗（1∶10 000）避光孵育1 h，以Tubulin作为内参，显影、曝光，测定蛋白条带灰度值进行分析。
2.2.8 Mito-tracker-Red探针检测细胞线粒体荧光无水DMSO配制Mito-tracker-Red储存液至终浓度1 mmol/L。配制后于-20 ℃避光保存。取1 mmol/L储存液无血清培养基稀释成终浓度为300 nmol/L，混匀后即为工作液。将12孔板中加入37 ℃预热的工作液，与细胞37 ℃共孵育30 min后，去除工作液，加入37 ℃预温育的新鲜细胞培养液，采用荧光显微镜进行观察。
2.2.9 苏木精-伊红（HE）染色观察C57BL/6J小鼠iWAT脂肪组织形态将小鼠iWAT在4% 多聚甲醛中固定24 h，然后在不同浓度的乙醇中脱水。脱水后，组织在二甲苯中透明，然后在熔化的石蜡中包埋并切片。将切片粘贴在载玻片上，并在45 ℃培养箱中干燥。染色前用二甲苯去除切片中的石蜡，然后将切片通过高浓度到低浓度的乙醇，最后放入蒸馏水中。最后，用苏木精和伊红溶液染色，然后密封。
2.2.10 血脂水平的测定小鼠处死眼眶取血后，血液于室温放置2 h，在3 500 rpm下4 ℃离心10 min，分离上层血清，置于-80 ℃保存。根据试剂盒测定血脂指标，采用全自动生化分析仪检测血清中TG、TC、HDL-C和LDL-C的浓度。
2.2.11 统计学方法采用SPSS 19.0和Graphpad Prism 8.2.1软件进行统计及作图，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验，组间生存率采用秩和检验（Log-rank test）法比较。统计学数据满足方差齐性（Levene检验）及正态性（Shapiro-Wilk）。P < 0.05表示差异具有统计学意义。
3 结果 3.1 网络药理学分析 3.1.1 数据库中与产热相关的共表达DEGs的筛选GSE13432数据集中一周与五周冷暴露共表达差异基因507个，其中包括298个上调基因与209个下调基因（图 1a-b）。
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| 注：图a，数据集中差异基因表达的火山图；图b，数据集中共表达DEGs的筛选；图c，共表达DEGs的GO富集分析；图d，共表达DEGs的KEGG通路分析；图e，差异表达基因的PPI网络；图f，中枢基因网络（红色代表上调基因，蓝色代表下调基因）；图g，ITCM数据库中筛选出的中药单体。 图 1 网络药理学分析 |
GO富集分析中的BP结果显示，共表达DEGs主要在脂肪酸氧化（fatty acid beta-oxidation）、对寒冷的反应（response to cold）、三羧酸循环（neutrophil activation involved in immune response）、线粒体ATP合成与质子传输耦联（mitochondrial ATP synthesis coupled proton transport）、棕色脂肪细胞分化（brown fat cell differentiation）等子集中富集；CC分析结果显示，共表达DEGs主要在线粒体（mitochondrion）、线粒体内膜（mitochondrial inner membrane）、过氧化物酶体基质（peroxisomal matrix）、细胞质基质（cytosol）等子集中富集；MF分析结果显示，共表达DEGs主要定位在氧化还原酶活性（oxidoreductase activity）、相同蛋白质结合（identical protein binding）、乙酰辅酶A C-酰基转移酶（Acetyl-CoA C-acetyltransferase）、丙酮酸脱氢酶[pyruvate dehydrogenase（NAD+）activity]等子集（图 1c）。
KEGG通路分析结果显示，共表达的DEGs主要与产热（Thermogenesis）、过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路（PPAR signaling pathway）、磷酸腺苷活化蛋白激酶信号通路（AMPK signaling pathway）、脂肪酸代谢（Fatty acid metabolism）等通路有关，共表达DEGs在调节能量代谢、脂质代谢和体温维持等方面发挥重要作用（图 1d）。
3.1.3 PPI的构建与Hub基因的鉴定STRING平台构建共表达基因的PPI网络互作图（图 1e），Cytoscape软件筛选Degree中位值（8）至最大值（82）之间的基因，共得到143个hub基因（图 1f、表 3），其中与产热呈正相关（上调）的基因有111个，呈负相关（下调）的基因有32个。
| DEGs | 基因名称 |
| 上调基因 | Ucp1、Dio2、Elovl3、Ppara、Ppargc1a、Mtor、Cidea、Hspa9、Slc27a2、Slc25a20、Gpd2、Pdk4、Gja1、Idh3a、Coq8a、Acaa2、Txnrd2、Idh3b、Acadvl、Hadha、Uqcr10、Pfkl、Dlst、Ndufab1、Etfdh、Cs、Dlat、Hadhb、Ppif、Acacb、Aco2、Fbp2、Cox15、Mecr、Hsd17b12、Ndufa10、Me3、Lipt1、Decr1、Suclg1、Pdhb、Slc27a1、Coasy、Mlycd、Cpt2、Sod2、Coq9、Uqcrc1、Ndufs8、Pgk1、Cycs、Pdhx、Apoo、Coq6、Timm44、Mrpl47、Acadl、Uqcrq、Hacl1、Sdhd、Gfm1、Hsdl2、Sirt3、Coq5、Ndufv1、Mrps36、Foxred1、Ogdh、Mrps2、Prkaa2、Uqcrfs1、Eci1、Sucla2、Mrpl50、Idh3g、Tkt、Acat2、Ndufa12、Cyc1、Dld、Mtx2、Pgam1、Uqcrc2、Acat1、Ndufs1、Ehhadh、Acadm、Afg3l2、Mrpl44、Ndufs4、Samm50、Ubc、Ndufv2、Ndufb5、Ndufb8、Pmpcb、Nudt12、Hadh、Ndufaf4、Pdss1、Cox10、Ptcd3、Ech1、Ndufs7、Sdha、Cox7a1、Hk2、Scp2、Hsd17b4、Atp5f1a、Micos10 |
| 下调基因 | Vcam1、Cxcl13、Arrb2、Trim21、Ddx58、Hmgcr、Sec61a1、Nnt、Cd40、Gpx3、Ccr2、Ccl5、Cxcr6、Nkg7、Lck、Icos、Slc25a24、Cxcl16、Lcp2、Calml4、Cd44、Igf1、Hnrnpa1、Cd48、Cybb、Cd8a、Trat1、Gzma、Cd3d、Il7r、Plek、Cd27 |
与共表达基因正相关的7个中药单体分别是α-松油醇（α-Terpineol，α-TE）、欧前胡素（Imperatorin，IMP）、胡黄连苷Ⅰ（Picroside I，PI）、松脂醇二葡萄糖苷（Pinoresinol diglucoside，PD）、异鼠李素-3-O-新橙皮苷（Isorhamnetin-3-O-neohespeidoside，IN）、东莨菪碱氢溴酸盐（scopolamine hydrobromide）、染料木苷（Genistin），通过查阅文献，染料木苷已被证实具有减轻iWAT重量，增加能量消耗的功能[22]，东莨菪碱氢溴酸盐是有毒的中药单体故排除。剩余5个中药单体经查阅文献发现都没有促白色脂肪棕色化的报道。后期细胞实验验证5个中药单体促棕色化的作用（图 1g）。
3.1.5 促细胞棕色分化的中药单体筛选五种中药单体均可上调棕色化基因Ucp1、Prdm16、PGC-1α和Cidea，脂肪酸氧化基因Pparα的表达，抑制脂质合成基因Pparγ表达。IMP、IN、PI、α-TE、PD干预组Ucp1产热基因表达量分别是对照组的1.5倍，1.4倍，1.4倍，1.3倍，1.2倍；Prdm16基因表达量分别是2倍，1.8倍，1.9倍，1.8倍，1.5倍、1.8倍。五个单体中IMP的Ucp1和Prdm16基因表达值最高，故选择IMP进行后续实验（表 4）。
| 组别 | 样本数 | Ucp1 | Prdm16 | Pgc-1α | Cidea | Pparγ | Pparα |
| Con | 3 | 1.00±0.15 | 1.00±0.06 | 1.01±0.13 | 1.00±0.39 | 1.00±0.09 | 1.00±0.05 |
| IN | 3 | 1.46±0.42* | 1.89±0.58 | 1.75±0.23* | 3.24±0.61** | 0.64±0.16** | 1.19±0.05 |
| IMP | 3 | 1.52±0.29* | 2.1±0.48* | 1.62±0.07 | 3.33±0.67** | 0.93±0.09 | 1.18±0.06 |
| PD | 3 | 1.29±0.14 | 1.86±0.82 | 1.81±0.68* | 2.91±1.19* | 0.86±0.15 | 1.47±0.22* |
| PI | 3 | 1.42±0.07 | 1.97±0.28 | 1.64±0.17 | 2.2±0.33 | 0.99±0.21 | 1.23±0.12 |
| α-TE | 3 | 1.31±0.2 | 1.56±0.22 | 1.33±0.06 | 1.83±0.19 | 0.7±0.11* | 1.03±0.14 |
| 注：*P < 0.05，**P < 0.01。 | |||||||
不同浓度欧前胡素中，与对照组比较，IMP浓度大于10 µmol/L时，细胞存活率降低，故选择对细胞活性无影响的最大浓度10 µmol/L为最佳剂量，1、3 µmol/L为低、中剂量进行后续实验（图 2a）。
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| 注：图a，不同浓度IMP对3T3-L1细胞活性的影响；图b-c，IMP对3T3-L1细胞脂质积累的影响（油红O，×20）；图b，脂滴含量；图c，脂滴形态；图d，UCP1相对荧光强度；图e，线粒体相对数量；图f，IMP对3T3-L1细胞UCP1相对荧光强度、线粒体数量的影响（免疫荧光，×20），x±s，n=3。与对照组比较，**P < 0.01。 图 2 细胞实验结果 |
对3T3-L1前脂肪细胞进行诱导8 d后，使用显微镜对染色后的脂滴进行观察，可以直观地看到对照组出现大量脂滴，分布密集，呈“戒环状”排列；欧前胡素10µm/L组细胞脂滴相对较小，分布稀疏，含量显著少于对照组（图 2b-c）。表明欧前胡素可抑制脂肪细胞的脂质累积。
3.2.3 欧前胡素对3T3-L1细胞UCP1蛋白表达的影响与对照组比较，欧前胡素组显著增加3T3-L1前脂肪细胞线粒体UCP1蛋白的免疫荧光强度（P < 0.01），高于对照组1.6倍，图 2d、2f-UCP1组。
3.2.4 欧前胡素对3T3-L1细胞线粒体数量的影响用Mito Tracker red对分化的脂肪细胞进行染色，结果显示，与对照组相比，IMP处理的脂肪细胞中的信号更强，线粒体数量相对增多，是对照组的1.7倍。（P < 0.01，图 2e、2f-Mito-tracker-Red组），此外，为了进一步阐明IMP对线粒体生物发生的影响，测定了线粒体生物发生的标记基因的表达水平。10 µmol/LIMP增加了线粒体合成基因Tfam、Nrf1、Opa1的表达（P < 0.05或P < 0.01，图 4）。
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| 注：图a，IMP给药期间各组小鼠的体质量变化；图b，IMP给药后对小鼠生存时间的变化；图c，欧前胡素对小鼠血脂TG、TC、LDL-C、HDL-C的影响。数据表示为x±s（n=5~12）；图d，IMP给药后各组小鼠iWAT脂肪组织HE染色及UCP1免疫组化图；图e，UCP1蛋白阳性细胞比，数据表示为（x±s，n=3），与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。 图 3 动物实验结果 |
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| 注：数据表示为（x±s，n=3）。与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。 图 4 欧前胡素对3T3-L1细胞棕色化基因mRNA表达 |
生存实验是评估药物安全性和有效性的重要步骤。与对照组相比，IMP延长了小鼠在寒冷环境下的生存时间（图 6b）。各组的中位生存时间：对照组为137 min，15 mg/kg组为186 min，30 mg/kg组为149 min，阳性对照组300 min内没死。相比于对照组，低剂量组小鼠生存时间显著延长1.35倍（P < 0.01）高剂量组小鼠生存时间延长1.08倍，结果说明欧前胡素可提升小鼠耐寒力。
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| 注：数据表示为（x±s，n=3）。与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。 图 5 欧前胡素对iWAT棕色化基因mRNA表达 |
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| 注：数据表示为（x±s，n=3）。与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。 图 6 欧前胡素作用3T3-L1细胞产热、通路生物发生标志性蛋白表达电泳 |
血脂检测可以及时反映体内脂类代谢情况。与对照组相比，给药后小鼠体质量整体趋势增长缓慢，2W-CE组置4 ℃当天体质量下降较快，后期上升（图 3a）。测量血脂发现给药组与2W-CE组血清中TG、TC、LDL-C降低，HDL-C升高。结果显示欧前胡素能改善小鼠血脂水平，增强血液循环，从而提升耐寒力（图 3c）。
3.2.7 欧前胡素对小鼠iWAT组织HE及IHC染色影响HE染色观察脂肪形态变化，并利用免疫组化分析表达棕色化标志物UCP1的阳性细胞数量，探究IMP对iWAT棕色化的影响。本研究观察到IMP给药组、2W-CE小鼠的iWAT的脂滴均显著小于正常小鼠，单位面积细胞数目增多。免疫组化结果表明高剂量IMP和2W-CE干预小鼠显著增加了UCP1阳性细胞数量，（P < 0.01，图 3e）。理化结果表明IMP能够消耗小鼠腹股沟脂肪从而产热预防寒冷，并证明了欧前胡素具有促白色脂肪棕色化作用（图 3d）。
3.2.8 欧前胡素对3T3-L1细胞棕色化基因表达水平的影响3T3-L1细胞随着IMP浓度的升高，相关基因Ucp1、Pgc-1α、Prdm16 mRNA表达逐渐上升，脂质合成基因Pparγ、C/EBP mRNA表达下降。最优浓度10µmol/L欧前胡素提高米色特异性基因Cited1、Cd137、Dio2、Tmem26 mRNA水平（P < 0.05或P < 0.01，图 4）。
3.2.9 欧前胡素对小鼠iWAT棕色化基因表达水平的影响不同浓度的IMP对小鼠iWAT棕色化影响不同。随着IMP给药剂量的上升，低剂量与高剂量基因表达呈递进关系。高剂量组30 mg/kg显著增强棕色化基因Ucp1、Pgc-1α、Prdm16 mRNA（P < 0.05或P < 0.01）表达，米色特异性基因Cd137、Cited1、Dio2 mRNA表达，低剂量15 mg/kg显著增强Cidea mRNA表达，两种剂量都显著降低脂质合成基因Pparγ、C/EBP mRNA表达，增强线粒体生物合成基因Nrf1、Tfam表达（P < 0.05或P < 0.01，图 5）。
3.2.10 欧前胡素对脂肪棕色化基因蛋白水平变化随着欧前胡素浓度的升高，细胞水平上UCP1、PGC-1α、PRDM16、PPARα、P-AMPK、Sirt1蛋白表达水平呈上升趋势（图 6），加入IMP和抑制剂Dorsomorphin均逆转各蛋白表达。证明Dorsomorphin能有效遏制IMP在AMPK通路上的蛋白表达（图 7）。动物水平上高剂量组显著升高UCP1、PGC-1α、P-AMPK、Sirt1蛋白表达，降低PPARγ（P < 0.05或P < 0.01）蛋白表达（图 8）。证明IMP在iWAT中可激活AMPK/Sirt1/PGC-1α信号通路，促进白色脂肪棕色化的发展。
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| 注：数据表示为（x±s，n=3）。与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。 图 7 欧前胡素和多索吗啡作用3T3-L1细胞产热、通路生物发生标志性蛋白表达电泳 |
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| 注：数据表示为（x±s，n=3）。与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。 图 8 30 mg/kg欧前胡素作用iWAT脂肪产热、通路生物发生标志性蛋白表达电泳 |
基于基因表达谱的计算筛选已成为药物发现的最有效方法之一[23]。通过网络药理学与中药活性转录图谱平台ITCM筛选出五个中药单体，细胞水平上都上调产热基因的表达，UCP1在棕色化脂肪中是特异性且高度表达的一个线粒体蛋白。UCP1基因表达升高与机体的抗寒能力密切相关。所以将UCP1作为重要的标志物来研究白色脂肪棕色化的产热功能[24]。其中欧前胡素（IMP）促进Ucp1上调的效果最好。
寒冷环境下，皮下脂肪为身体提供保温层，帮助维持体温。白色脂肪棕色化能增加能量消耗，参与非颤抖性产热，调节体温[25]。本研究结果显示，IMP可剂量依赖性提升细胞与动物水平上Ucp1的表达，为探索小鼠对寒冷环境的适应性和耐寒性提供了关键性的理论支持。-15℃极寒温度下，低剂量组小鼠在极寒环境中的存活时间更长，推测是高剂量组更有效地诱导脂肪棕色化，产热能力大，机能耗竭更快，不利于机体在极寒温度下生存的原因导致，证明产热在一定合适的剂量上最佳。
白色脂肪棕色化是一个复杂的过程，转化期间产生的线粒体对于维持体温，增加新陈代谢至关重要[26]。PGC-1α和Prdm16是棕色化细胞中产热代谢的调控因子，过度表达能显著促进线粒体的生物合成[27-29]。米色特异性基因Cidea、Cited1、Cd137调控棕色脂肪发育与分化，是评估米色脂肪的理想指标[30]。这些基因表达的增加会导致棕色脂肪特异性增强，在能量代谢和适应产热中发挥着重要的调节作用。PPARγ和C/EBP是调节脂质生成、诱导分化成熟脂肪的转录因子，在白色脂肪细胞中存在特异性的结合位点，利用棕色化后细胞的能量燃烧特性来增加产热。IMP能有效抑制脂质积累，参与线粒体呼吸调节，增加白色脂肪棕色化活性。AMPK是细胞和生物体代谢的关键调节器，能够维持能量稳态，在调节白色脂肪棕色化方面起着至关重要的作用。沉默信息调节因子1（Sirt1）是AMPK信号通路的枢纽，是NAD+依赖的去乙酰化酶，通过调控蛋白之间相互作用和去乙酰化修饰促进能量代谢。AMPK通过其磷酸化和Sirt1之间相互作用调节，使下游靶点PGC-1α去乙酰化激活，进而提升UCP1的表达。细胞实验中加入AMPK抑制剂Dorsomorphin可阻断对棕色化脂肪的作用，证明欧前胡素通过AMPK/Sirt1/PGC-1α信号通路促进脂肪棕色化。
综上所述，网络药理学筛选的中药单体IMP通过调控AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路抑制脂滴生成，增加棕色化标志性基因及蛋白表达。本研究仍有不足，1）探讨了欧前胡素在常温下促白色脂肪棕色化的作用机制，但在寒冷环境中并未进一步得到验证，且药物有效剂量会不会随着环境的改变还有待确定。2）本实验仅仅验证了腹股沟白色脂肪棕色化的作用，其皮下肩胛间脂肪及内脏附睾白色脂肪并未研究。3）与其相关的具体作用机制未进行深入探究。后期将继续研究欧前胡素对其他脂肪组织的影响及与寒冷环境的协同作用，深度探讨调控脂肪代谢具体的分子机制，为预防代谢类疾病和提升机体耐寒力提供明确的靶向和对应的干预措施。
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