2026, Vol. 45文章信息
- 邓开, 孙婉瑾, 张英溶, 黄伟
- DENG Kai, SUN Wanjin, ZHANG Yingrong, HUANG Wei
- 温阳扶正膏中双酯型生物碱的限量测定及急性毒性实验研究
- Limit determination of diester alkaloids in Wenyang Fuzheng ointment and experimental study on acute toxicity
- 天津中医药大学学报, 2026, 45(2): 190-198
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2026, 45(2): 190-198
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2026.02.09
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文章历史
收稿日期: 2025-11-15
引用本文 |
2. 湖北时珍实验室, 武汉 430061;
3. 湖北中医药大学附属医院, 武汉 430061
2. Hubei Shizhen Laboratory, Wuhan 430061, China;
3. Affiliated Hospital of Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430061, China
中药材附子是毛茛科植物乌头的子根的加工品[1]。附子属大毒之品，外用则可减少其不良反应[2]。含附子的外用制剂在心力衰竭、各种疼痛、炎症、肿瘤等疾病的治疗中应用广泛，并产生了良好的社会效益[3]。
附子中所含的双酯型生物碱有较大的毒性[4]，乌头碱、新乌头原碱、次乌头原碱是附子中含量较多的双酯型生物碱，也是附子及其中药制剂中主要的毒性成分[5]。因此，含附子的外用制剂的安全性问题也受到了临床医生、药师和患者的高度关注。现有研究发现双酯型生物碱经炮制后可水解成单酯型生物碱或氨基醇类生物碱，从而使附子毒性大大降低[6-7]。故临床多采用炮制、合理配伍等方法以达到减毒的目的[8-12]。有文献指出附子的毒性大小与煎煮时间密切相关，煎煮时间不足或煎煮方法不当是附子中毒的原因之一[13]。目前，对含有附子的外用制剂在安全性、毒性方面的看法仍存在一些争议，缺少相关的系统的安全性实验研究，而含毒性药材的外用制剂的质量标准中也没有对其急性毒性实验作明确具体的规定[14-16]。
外用制剂温阳扶正膏的处方由附子等五味中药组成，该制剂的基质是凡士林。为考察含附子的外用制剂的安全性并做出客观、科学的评价，为这类制剂的临床应用提供安全性依据。本研究中附子的炮制工艺为：取泥附子，按大小分别洗净，浸入胆巴的水溶液中数日，连同浸液煮至透心，捞出，水漂，纵切成厚约0.5 cm的片，再用水浸漂，用调色液使附片染成浓茶色，取出，蒸至出现油面、光泽后，烘至半干，再晒干或继续烘干，习称“黑顺片”。本研究以处方中含有附子的外用制剂温阳扶正膏为研究对象进行双酯型生物碱限量测定、单次给药急性毒性实验、皮肤刺激实验和皮肤致敏性实验，对于后续指导这类含附子的外用制剂的研发和确保临床安全合理地使用这类制剂具有重大意义。
1 仪器与试药 1.1 仪器Waters 2695高效液相色谱系统（含2996二极管阵列检测器、自动进样器及色谱工作站，美国Waters公司）；Agilent ZORBAX Extend C18色谱柱（4.6×250 mm，5 µm）（美国Agilent公司）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；超纯水净化器（西安优普仪器设备有限公司）；E12140 Explorer万分之一分析天平（瑞士Metler-Toledo公司）；ES225SM-DR十万分之一电子天平（瑞士普利赛斯公司）；电子天平秤（SHIMADZU，型号：AUW120D）；电推剪（温州卓创电器有限公司，型号：DDG-S02）；无菌注射器（江苏华达医疗器械有限公司5 ml）；无刺激性纱布（江西大卫医疗器械有限公司A1型5×7 cm）；医用透气胶带（可孚医疗科技股份有限公司5 cm×9 m）；一次性医用橡胶手套（南昌飞翔乳胶制品有限公司橡胶无粉型M）。
1.2 试药乌头碱对照品（上海同田生物技术有限公司提供，批号：302-27-2，纯度≥98.0%）、新乌头原碱对照品（成都普思生物科技股份有限公司提供，批号：PS0489-0025，纯度≥98.0%）；次乌头原碱对照品（成都普思生物科技股份有限公司提供，批号：PS0462-0025，纯度≥98.0%）；乙腈、四氢呋喃、异丙醇为色谱纯，二氯甲烷、乙酸乙酯、醋酸铵、冰醋酸为分析纯，水为超纯水。温阳扶正膏（批号：20210601、20210602、20210603）均由湖北省中医院制剂中心生产；凡士林（生产批号：20210402）；生理盐水（产品批号：2101163702）；75% 医用乙醇（产品批号：20210108）；10% 福尔马林中性固定液（产品批号：210906）；2，4-二硝基氯化苯（梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，分析纯，批号：WT6CAMV）。
1.3 实验动物SPF级SD大鼠80只，雌雄各半，体质量180~200 g，购于三峡大学实验动物中心（动物质量合格证编号：42010200006504），许可证号：SCXK（鄂）2017-0012，均自由饮食、饮水，并分笼饲养，安静环境，室温20~25 ℃，相对湿度50%~65%，每日光照12 h。
豚鼠110只，雌雄各半，清洁级，体质量260~ 280 g，购于湖北中医药高等专科学校实验动物中心（动物质量合格证编号：42815900000087），许可证号：SCXK（鄂）2019-0017，均自由饮食、饮水，并分笼饲养，安静环境，室温20~25 ℃，相对湿度45%~ 55%，每日光照12 h。
动物饲养于湖北省中医院动物实验中心，本研究所涉及的动物实验经湖北省中医院实验动物委员会批准，（批准号：HBZY2018-B15-01）。所有操作均遵守实验动物伦理要求。
2 实验方法 2.1 色谱条件与系统适用性试验参照《中国药典》和相关文献中双酯型生物碱的含量测定方法[17-19]。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-四氢呋喃（25∶15）为流动相A，以0.1 mol/L醋酸铵溶液为流动相B，按表 1中的规定进行梯度洗脱，流速为1 mL/min，柱温为25 ℃，进样体积为10 µL，检测波长为235 nm。
| 时间（t/min） | 流动相A（%） | 流动相B（%） |
| 0~48 | 15~26 | 85~74 |
| 48~49 | 26~35 | 74~65 |
| 49~58 | 35 | 65 |
| 58~65 | 35~15 | 65~85 |
参照《中国药典》中提取双酯型生物碱的制样方法[1]。
2.2.1 对照品溶液的制备取乌头碱对照品、新乌头原碱对照品、次乌头原碱对照品适量，精密称定，加异丙醇-二氯甲烷（1∶1）混合溶液制成每1 mL各含0.3 mg的混合溶液，即得。
2.2.2 供试品溶液的制备称取温阳扶正膏30 g，精密称定，加入二氯甲烷80 mL，40 ℃水浴加热充分搅拌使基质溶解，静置片刻待药粉沉淀，过滤，弃去二氯甲烷液，取滤渣挥干溶剂，用氨试液10 mL润湿，精密加入异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz，水温在25 ℃以下）30 min，放冷，再称定重量，用异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL，40 ℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇-二氯甲烷（1∶1）混合溶液5 mL溶解，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3 阴性样品溶液的制备按处方组成及比例，取除去黑顺片以外的其余药材，按照温阳扶正膏制备工艺制备阴性样品。取阴性样品30 g，同供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。
2.3 急性毒性实验 2.3.1 动物分组及动物数单次给药急性毒性实验：取SPF级SD大鼠40只，体质量180~200 g，按性别体质量序随机分成4组，分别为温阳扶正膏完整皮肤组（13.7025 g生药/kg）、温阳扶正膏破损皮肤组（13.702 5 g生药/kg）、基质完整皮肤组（26.355 g凡士林/kg）、基质破损皮肤组（26.355 g凡士林/kg），每组10只，雌雄各半。急性毒性实验的给药剂量为临床实际外用剂量的一百倍，实验剂量远超临床常用剂量。
多次给药急性毒性实验：取SPF级SD大鼠40只，体质量180~200 g，按性别体质量序随机分成4组，分别为温阳扶正膏完整皮肤组（13.702 5 g生药/kg）、温阳扶正膏破损皮肤组（13.702 5 g生药/kg）、基质完整皮肤组（26.355 g凡士林/kg）、基质破损皮肤组（26.355 g凡士林/kg），每组10只，雌雄各半。在多次给药急性毒性试验中每隔8小时给药1次，每天给药2次，连续给药7 d。
2.3.2 给药方法及观察给药前24 h对各组大鼠背部脊柱两侧皮肤用电推剪进行脱毛处理，面积为40 mm×50 mm，脱毛处皮肤均予以75% 医用乙醇消毒。其中各破损皮肤组用一次性消毒针头轻轻划伤脱毛处皮肤至轻度渗血。对各组大鼠均相应给药，并用无刺激性纱布覆盖及医用透气胶带固定。每隔8 h给药1次，每日给药2次，给药后24 h用生理盐水去除受试药物。给药后随即观察并记录每只大鼠的体质量、进食、行为、精神状态、皮肤、毛发、分泌物、排泄物、死亡情况、中毒反应、14 d后处死大鼠，进行病理组织学检查。
2.4 皮肤刺激实验 2.4.1 动物分组及动物数单次给药皮肤刺激性实验：取清洁级豚鼠40只，体质量260~-280 g，按性别体质量序随机分成4组，分别为温阳扶正膏完整皮肤组（予以温阳扶正膏9.4308 g/kg）、温阳扶正膏破损皮肤组（脱毛处皮肤用无菌注射器针头划一“井”字划痕，至表皮层轻微渗血，予以温阳扶正膏9.430 8 g/ kg）、基质完整皮肤组（予以凡士林18.14 g/kg）、基质破损皮肤组（脱毛处皮肤用无菌注射器针头划一“井”字划痕，至表皮层轻微渗血，予以凡士林18.14 g/kg），每组10只，雌雄各半。
多次给药皮肤刺激性实验：取清洁级豚鼠40只，体质量260~280 g，按性别体质量序随机分成4组，分别为温阳扶正膏完整皮肤组（予以温阳扶正膏9.430 8 g/kg）、温阳扶正膏破损皮肤组（脱毛处皮肤用无菌注射器针头划一“井”字划痕，至表皮层轻微渗血，予以温阳扶正膏9.430 8 g/kg）、基质完整皮肤组（予以凡士林18.14 g/kg）、基质破损皮肤组（脱毛处皮肤用无菌注射器针头划一“井”字划痕，至表皮层轻微渗血，予以凡士林18.14 g/kg），每组10只，雌雄各半。在多次给药皮肤刺激性实验中每隔24 h给药1次，连续7 d。
2.4.2 给药方法及观察各组均予以脱毛处理（脊柱两侧）并消毒，脱毛面积为40 mm×50 mm。其中，温阳扶正膏完整皮肤组和温阳扶正膏破损皮肤组豚鼠仅在左侧脱毛处予以温阳扶正膏相应剂量生药，用透明膜包封、无刺激性纱布覆盖、胶带固定。基质完整皮肤组和基质破损皮肤组豚鼠仅在右侧脱毛处均匀涂抹相应剂量凡士林，并用透明膜包封、无刺激性纱布覆盖、胶带固定。给药后24 h用生理盐水去除受试药物。在去除受试药物后1、24、48和72 h观察并记录局部皮肤有无红斑、水肿等反应及其消退情况。
2.5 皮肤致敏性实验 2.5.1 动物分组及动物数取清洁级豚鼠30只，体质量260~280 g，按性别体质量序随机分成3组，分别为温阳扶正膏组：予以脱毛处理（背部两侧），脱毛面积为40 mm×50 mm，于背部左侧脱毛处均匀涂以温阳扶正膏18.17 g/kg，用透明膜包封、无刺激性纱布覆盖、胶带固定；阳性对照组（2，4-二硝基氯化苯）：予以脱毛处理（背部两侧），脱毛面积为40 mm×50 mm，于背部左侧脱毛处均匀涂以2，4-二硝基氯化苯0.2 mL，用透明膜包封、无刺激性纱布覆盖、胶带固定；阴性对照组（凡士林）：予以脱毛处理（背部两侧），脱毛面积为40 mm×50 mm。背部左侧脱毛处均匀涂以凡士林18.17 g/kg，用透明膜包封、无刺激性纱布覆盖、胶带固定。每组10只，雌雄各半。
2.5.2 给药方法及观察给药后6 h用生理盐水去除受试药物，在第7天和第14天各重复给药1次。末次致敏接触试验后进行激发接触实验，即用同样方法将药物分别涂于上述的三组豚鼠背部右侧脱毛处，给药后6 h用生理盐水去除受试药物，在去除药物后0、24、48和72 h观察皮肤过敏反应情况。
2.6 统计学分析计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，当数据符合正态分布且满足方差齐性时，组间比较采用单因素方差分析，不同时满足正态分布及方差齐性的数据采用非参数检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
3 结果 3.1 检测限取乌头碱对照品、新乌头原碱对照品、次乌头原碱对照品溶液逐步稀释，精密吸取10 µL，注入液相色谱仪，按2.1所述色谱条件进行测定，记录色谱峰高，取信噪比为3∶1时溶液的浓度为检测限，结果表明3种对照品检测限浓度分别为5.73、5.92和5.56 µg/mL。
3.2 样品中双酯型生物碱的限量测定取3批温阳扶正膏（批号：20210601、20210602、20210603）各约30 g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液。分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 µL，按2.1项下色谱条件进样测定，3批温阳扶正膏及阴性样品均未检测出乌头碱、新乌头原碱、次乌头原碱，典型色谱图见图 1。
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| 注：图A，新乌头原碱；图B，次乌头原碱；图C，乌头碱。 图 1 温阳扶正膏双酯型生物碱限量测定典型色谱图 |
在整个观察期间，所有大鼠正常生长、毛色、行为活动、饮水、饮食及大小便均正常，口鼻耳处无异常分泌物，无一动物死亡。单次给药组各个大鼠皮肤给药处均正常，未见皮肤红斑水肿等症状。多次给药组涂药后第7天仅2只大鼠出现短暂的轻微红斑，其他大鼠皮肤给药处均正常。见图 2、图 3。
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| 图 2 单次给药组大鼠的皮肤反应 |
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| 图 3 多次给药组大鼠的皮肤反应 |
温阳扶正膏单次给药实验及多次给药实验中，各给药组大鼠体质量与阴性对照组比较无明显差异（结果见表 2、表 3），提示一定剂量的温阳扶正膏外用对大鼠体质量无明显影响。
| 组别 | 第1天 | 第2天 | 第3天 | 第4天 | 第7天 | 14天 |
| 完整皮肤给药组 | 185.93±3.58 | 190.44±3.52 | 197.17±4.54 | 202.96±6.26 | 230.10±5.45 | 289.67±2.75 |
| 完整皮肤对照组 | 183.80±2.20 | 189.05±2.73 | 198.45±2.59 | 203.90±2.33 | 230.30±1.89 | 287.7±3.40 |
| 破损皮肤给药组 | 188.10±3.48 | 190.60±4.27 | 195.20±3.43 | 204.30±4.85 | 232.17±3.49 | 290.88±7.37 |
| 破损皮肤对照组 | 185.90±3.31 | 190.90±1.91 | 197.90±2.85 | 204.70±2.87 | 230.10±2.23 | 287.10±1.91 |
| 注：温阳扶正膏各给药组与对照组比较，P>0.05。 | ||||||
| 组别 | 第1天 | 第2天 | 第3天 | 第4天 | 第7天 | 14天 |
| 完整皮肤给药组 | 184.80±1.75 | 189.80±3.01 | 199.00±3.59 | 204.40±3.63 | 227.40±2.41 | 282.30±1.77 |
| 完整皮肤对照组 | 185.10±2.02 | 190.30±3.27 | 198.80±2.39 | 205.10±2.42 | 227.70±1.77 | 283.90±1.97 |
| 破损皮肤给药组 | 184.50±2.27 | 190.30±3.09 | 198.30±2.83 | 203.40±4.14 | 226.00±3.86 | 283.30±3.43 |
| 破损皮肤对照组 | 186.40±2.46 | 191.10±3.28 | 199.00±2.91 | 206.10±2.42 | 228.60±2.91 | 284.20±2.90 |
| 注：温阳扶正膏各给药组与对照组比较，P>0.05。 | ||||||
对各组大鼠的皮肤进行病理学检查，均未见异常明显的炎症病变，具体情况如下。
单次给药对SD大鼠急性毒性实验病理学检验报告：
温阳扶正膏完整皮肤组与基质完整皮肤对照组相比，皮肤组织整体结构基本正常，表皮角质层结构清晰，未见明显角化过度角化不全，表皮细胞未见明显疏松水肿坏死，未见表皮明显增厚，真皮层胶原纤维排列较整齐胶原纤维数量丰富，未见胶原纤维明显肿胀断裂坏死，组织未见明显炎症细胞浸润。见图 4、图 5。
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| （HE染色，×100），标尺=100 µm 图 4 温阳扶正膏完整组皮肤组织学影像 |
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| （HE染色，×100），标尺=100 µm 图 5 基质完整组皮肤组织学影像 |
温阳扶正膏破损皮肤组与基质破损皮肤对照组相比，组织整体结构轻度异常，表皮角质层结构清晰，未见明显角化过度角化不全，角质层表皮细胞未见明显疏松水肿坏死，未见表皮明显增厚，组织真皮层可见胶原纤维轻微断裂，组织可见少量炎症细胞浸润。见图 6、图 7。
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| （HE染色，×100），标尺=100 µm 图 6 温阳扶正膏破损组皮肤组织学影像 |
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| （HE染色，×100），标尺=100 µm 图 7 基质破损皮肤组皮肤组织学影像 |
多次给药对SD大鼠急性毒性实验病理学检验报告：
温阳扶正膏完整皮肤组与基质完整皮肤对照组相比，皮肤组织整体结构基本正常，表皮角质层结构清晰，未见明显角化过度角化不全，表皮细胞未见明显疏松水肿坏死，未见表皮明显增厚，真皮层胶原纤维排列较整齐胶原纤维数量丰富，未见胶原纤维明显肿胀断裂坏死，组织未见明显炎症细胞浸润。见图 8、图 9。
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| （HE染色，×100），标尺=100 µm 图 8 温阳扶正膏完整组皮肤组织学影像 |
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| （HE染色，×100），标尺=100 µm 图 9 基质完整组皮肤组织学影像 |
温阳扶正膏破损皮肤组与基质破损皮肤对照组相比，组织整体结构轻度异常，表皮角质层结构清晰，未见明显角化过度角化不全，表皮细胞未见明显疏松水肿坏死，未见表皮明显增厚，组织真皮层可见胶原纤维轻微断裂，组织未见明显炎症细胞浸润。见图 10、图 11。
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| （HE染色，×100），标尺=100 µm 图 10 温阳扶正膏破损组皮肤组织学影像 |
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| （HE染色，×100），标尺=100 µm 图 11 基质破损皮肤组皮肤组织学影像 |
图 4单次给药温阳扶正膏完整皮肤组，皮肤组织整体结构基本正常，表皮角质层结构清晰，未见明显角化过度角化不全，黄色箭头所示为角质层，表皮细胞未见明显疏松水肿坏死，未见表皮明显增厚，真皮层胶原纤维排列较整齐胶原纤维数量丰富，未见胶原纤维明显肿胀断裂坏死，组织未见明显炎症细胞浸润。
图 5单次给药基质完整皮肤组，皮肤组织整体结构基本正常，表皮角质层结构清晰，未见明显角化过度角化不全，黄色箭头所示为角质层，表皮细胞未见明显疏松水肿坏死，未见表皮明显增厚，真皮层胶原纤维排列较整齐胶原纤维数量丰富，未见胶原纤维明显肿胀断裂坏死，组织未见明显炎症细胞浸润。
图 6单次给药温阳扶正膏破损皮肤组，组织整体结构轻度异常，表皮角质层结构清晰，未见明显角化过度角化不全，黄色箭头所示为角质层，表皮细胞未见明显疏松水肿坏死，未见表皮明显增厚，组织真皮层可见胶原纤维轻微断裂，如图红色箭头所示，组织可见少量炎症细胞浸润，如图蓝色箭头所示。
图 7单次给药基质破损皮肤组，组织整体结构轻度异常，表皮角质层结构清晰，未见明显角化过度角化不全，表皮细胞未见明显疏松水肿坏死，未见表皮明显增厚，组织真皮层可见胶原纤维轻微断裂，如图红色箭头所示，组织可见少量炎症细胞浸润，如图蓝色箭头所示。
图 8多次给药温阳扶正膏完整皮肤组，皮肤组织整体结构基本正常，表皮角质层结构清晰，未见明显角化过度角化不全，黄色箭头所示为角质层，表皮细胞未见明显疏松水肿坏死，未见表皮明显增厚，真皮层胶原纤维排列较整齐胶原纤维数量丰富，未见胶原纤维明显肿胀断裂坏死，组织未见明显炎症细胞浸润。
图 9多次给药基质完整皮肤组，皮肤组织整体结构基本正常，表皮角质层结构清晰，未见明显角化过度角化不全，黄色箭头所示为角质层，表皮细胞未见明显疏松水肿坏死，未见表皮明显增厚，真皮层胶原纤维排列较整齐胶原纤维数量丰富，未见胶原纤维明显肿胀断裂坏死，组织未见明显炎症细胞浸润。
图 10多次给药温阳扶正膏破损皮肤组，组织整体结构轻度异常，表皮角质层结构清晰，未见明显角化过度角化不全，黄色箭头所示为角质层，表皮细胞未见明显疏松水肿坏死，未见表皮明显增厚，组织真皮层可见胶原纤维轻微断裂，如图红色箭头所示，组织未见明显炎症细胞浸润。
图 11多次给药基质破损皮肤组，皮肤组织整体结构基本正常，表皮角质层结构清晰，未见明显角化过度角化不全，黄色箭头所示为角质层，表皮细胞未见明显疏松水肿坏死，未见表皮明显增厚，真皮层胶原纤维排列较整齐胶原纤维数量丰富，未见胶原纤维明显肿胀断裂坏死，组织未见明显炎症细胞浸润。
3.4 皮肤刺激实验结果温阳扶正膏单次给药对完整皮肤豚鼠无皮肤刺激反应。对破损皮肤豚鼠有轻微皮肤刺激反应，在撤去药物1 h后有6只豚鼠出现轻微红斑未见水肿，在撤去药物24 h后，豚鼠红斑消失。温阳扶正膏多次给药对完整皮肤豚鼠无皮肤刺激反应。对破损皮肤豚鼠前2次给药未见皮肤刺激反应，从第3次给药至第7次给药后共计有9只豚鼠皮肤出现轻微红斑，无水肿，连续给药7 d后去除受试药物观察3 d，发现破损皮肤豚鼠的皮肤刺激反应消失，皮肤恢复正常，结果见表 4。
| 组别 | 分值类型 | 给药前 | 1 h | 24 h | 48 h | 72 h |
| 完整皮肤给药组 | 总分值 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 平均反应值 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 破损皮肤给药组 | 总分值 | 0 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 平均反应值 | 0 | 0.1 | 0.1 | 0 | 0 | |
| 完整皮肤对照组 | 总分值 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 平均反应值 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 破损皮肤对照组 | 总分值 | 0 | 0.5 | 0.5 | 0 | 0 |
| 平均反应值 | 0 | 0.05 | 0.05 | 0 | 0 |
温阳扶正膏组和阴性对照组（凡士林）在整个观察过程中未见受试区出现红斑及水肿。阳性对照组（2，4-二硝基氯化苯）自激发给药6 h后，受试区有严重的红斑出现，并有轻度的水肿出现，致敏率100%，结果见表 5、表 6。
| 组别 | 时间（h） | 红斑程度 | ||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | ||
| 温阳扶正膏组 | 6 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 24 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 48 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 72 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 阳性对照组 | 6 | 0 | 1 | 3 | 4 | 2 |
| 24 | 0 | 2 | 5 | 2 | 1 | |
| 48 | 3 | 4 | 2 | 1 | 0 | |
| 72 | 6 | 3 | 1 | 0 | 0 | |
| 阴性对照组 | 6 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 24 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 48 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 72 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 组别 | 时间（h） | 水肿程度 | ||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | ||
| 温阳扶正膏组 | 6 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 24 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 48 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 72 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 阳性对照组 | 6 | 5 | 3 | 1 | 1 | 0 |
| 24 | 7 | 1 | 2 | 0 | 0 | |
| 48 | 8 | 1 | 1 | 0 | 0 | |
| 72 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 阴性对照组 | 6 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 24 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 48 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 72 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
含附子的外用制剂种类繁多、适应症广[3, 20]，对含附子的外用制剂温阳扶正膏进行双酯型生物碱限量测定、单次给药急性毒性实验、皮肤刺激实验和皮肤致敏性实验研究关系着人民群众的用药安全。
温阳扶正膏适用于脾肾阳虚体质或兼有寒湿证之腰痹病，症见腰膝酸软，形寒肢冷，腹胀便溏，少气懒言，舌淡苔白，脉沉细等。
本研究急性毒性实验给药剂量和周期的确定严格遵循《中药、天然药物急性毒性研究指导原则》、《药物毒理学实验方法与技术》、《GBZ/T240.3- 2011化学品毒理学评价程序和试验方法第3部分：急性经皮毒性试验》中的有关规定，并参考了大量同类型的实验研究[21-27]，最终将单次给药急性毒性实验给药剂量和给药方法确定为13.702 5 g生药/kg，隔8 h给药1次，每日给药2次，给药后24 h用生理盐水去除受试药物。将多次给药急性毒性实验给药剂量和给药方法确定为13.702 5 g生药/kg，隔8 h给药1次，每天给药2次，给药后24 h用生理盐水去除受试药物，连续给药7 d。
实验结果显示，3批温阳扶正膏样品用现有的检测手段均未检测出乌头碱、新乌头原碱、次乌头原碱。温阳扶正膏皮肤外用安全，无毒性反应。温阳扶正膏无明显皮肤刺激反应，皮肤外用接触温阳扶正膏后无致敏作用。这可能与附子经炮制后其所含的主要毒性成分双酯型生物碱被水解有关[6]。同时，附子在净制、切制、炮制过程中经历浸、泡、漂等环节，也会使毒性物质流失[7]。
此外，本研究存在以下局限性：中药药理研究一直以来都是以现代医药学的理论、技术和方法为指导。现有的中药毒理学研究多参考现代毒理学方法即西医毒性研究方法，本研究也是如此。这种套用西医化的安全性评价方法虽然现阶段依然是常用、可行、可靠、经典的中药毒性研究方法[21-29]。但值得注意的是，一方面中药药理研究的病理模型忽视了“证”的表现，缺乏将现代科学方法与中医理论相结合的研究思路[30-31]。另一方面，中药毒性可分为固有毒性和特异质毒性（间接毒性）两种类型[32]，其中特异质毒性具有偶发性、隐匿性、易感性和难预测等特点，常规毒理学方法有时难以对其进行评价[32-33]。
针对现代药物安全性评价方法的局限性，只有突破“唯药物论毒性”的传统认知，不断创新中药毒性理论与安全性评价模式，提出新理论、新策略、新方法才能系统性地破解中药安全性评价与风险防控难题[34]。
近年来有研究团队传承创新发展中医“有故无殒”毒效思想，提出了“病证结合毒理学”理论和方法。该方法能突破常规毒理学模式和方法局限性，科学厘清遗传、体质、疾病和证候等机体因素对中药安全性的影响规律和主次关系，将“病”与“证”相结合，研究中药与机体相互作用规律并解决中药特异质毒性评价难题[32, 34]。
该研究团队接下来计划尝试将系统生物学、网络药理学、基因组学、蛋白质组学、代谢组学、分子对接技术、整合证据链法等技术手段和研究方法运用于温阳扶正膏的“病证结合毒理学”研究中，这既体现了中医的原创思维，又阐明了中药作用于疾病的现代科学内涵。利用病证结合毒理学通过多组分、多靶点、多途径的角度阐明温阳扶正膏在不同病证状态下的毒性成分、毒代动力学特点以及毒性作用的分子机制、考察毒性成分与病证的相互作用关系。从而科学系统地评价和预测温阳扶正膏的毒副作用和临床安全性，为临床安全合理用药提供可靠依据。
此外，“体质毒理学”也是中药安全性评价研究的新方向，其相较于传统毒理学研究，体质毒理学研究是以中医理论为指导，同时应用现代医学的研究手段，为精准防治中药不良反应事件的发生和阐明体质与中药毒性内在机理的联系提供了新思路，也为促进与中医理论相结合的中药安全性评价系统的构建提供了参考[30]。
但进行体质毒理学研究前也需要攻克以下难点：
第一，目前体质与药物损伤关系的研究比较有限，且临床上中药不良反应事件也较少进行体质特性的分析，尤其是部分中药长期应用产生的肝肾毒性，是否与体质不耐受有关，或用药过程中的体质改变有关，仍未可知。因此，中药安全性评价过程的体质变化研究亟待完善[30]。
第二，目前中药安全性的体质用药标准尚未统一，如剂量范围、毒性表型评价指标、体质禁忌等有待完善[30]。
第三，中药毒性研究尚未形成规范化研究体系，亟需完善中药毒性与体质研究的关系[30]。
尽管“体质毒理学研究”现阶段尚存在一些困难亟待解决，但其为温阳扶正膏的安全性评价与风险防控提供了新的思路和方法。通过对现存的问题进行反思，积极寻求突破的方法，努力优化完善体质毒理学的研究体系，其仍有望成为温阳扶正膏安全性评价的重要研究手段并帮助阐释温阳扶正膏药理作用的现代科学内涵。
综上，本研究以处方中含有附子的外用制剂温阳扶正膏为研究对象，对其进行了双酯型生物碱限量测定、单次给药急性毒性实验、皮肤刺激实验和皮肤致敏性实验，实验结果初步表明含附子的外用制剂对完整皮肤和破损皮肤均无刺激性、过敏性及毒性，初步验证了含附子的外用制剂的安全性，并探讨了后期若进一步进行温阳扶正膏“病证结合毒理学研究”和“体质毒理学研究”需要攻克的难点及相应的解决对策。为后续这类含有附子的外用制剂的临床应用和研发奠定了实验基础。
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