痤疮是累及毛囊皮脂腺单元的慢性炎症性皮肤病，全球患病率达9.4%，青少年发病率高达85%^[1]。其发病机制涉及雄激素诱导的皮脂分泌亢进、毛囊角化异常、痤疮丙酸杆菌增殖及炎症因子激活等多重因素^[2]。西医治疗以维A酸类、抗生素和抗雄激素药物为主，但存在耐药性增强（如克林霉素耐药率达78%）、皮肤刺激等局限^[3]。中医理论认为痤疮属“肺风粉刺”，多因湿热蕴结、血瘀痰凝所致，治疗强调清热凉血、解毒散结的整体调节，具有多靶点干预优势^[4]。

本处方由黄芩、丹参、野菊花、白花蛇舌草、红花、金银花、积雪草、厚朴、甘草组成，脱胎于《医宗金鉴》五味消毒饮与《外科正宗》凉血四物汤化裁，且经课题组前期研究证实，该处方对于痤疮的治疗效果良好^[5]。方中黄芩清肺胃热毒以治标，丹参活血化瘀以治本，两者共为君药，紧扣痤疮“热毒壅盛，血瘀湿滞”之核心病机，体现“清热凉血、解毒化瘀”的立方主旨；金银花、野菊花、白花蛇舌草助君药清热解毒，针对“热毒”之标；红花辅丹参活血化瘀，针对“血瘀”之变，共为臣药，强化君药功效；厚朴行气化湿，调畅中焦气机；积雪草清利湿热，兼护肌表，两者共为佐药，助君臣药分化湿热，防邪复聚；甘草既助黄芩、金银花解毒，又缓君臣药苦寒之性，调和全方，导药归经。

凝胶剂因其生物黏附性强、局部药物浓度高（透皮吸收率较乳膏提升30%~50%），且基质（如卡波姆）的降温收敛特性可缓解皮损红斑，成为痤疮外治的理想载体^[6]。研究通过现代制剂技术，以卡波姆-940为基质，制备复方中药凝胶，并对制备工艺进行考察，同时，建立兔耳痤疮模型，探究本凝胶对兔耳痤疮的治疗效果，最后，通过皮肤刺激性、致敏性试验，验证本凝胶的安全性。

1 材料和方法 1.1 仪器

磁力搅拌仪（SZCL-4B，巩义市予华仪器有限责任公司）；台式通用冷冻离心机（ST-16R，Thermo）；脱水机（Donatello，DIAPATH）；包埋机（JB-P5，武汉俊杰电子有限公司）；病理切片机（RM2016，上海莱卡仪器有限公司）；冻台（JB-L5，武汉俊杰电子有限公司）；组织摊片机（KD-P，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；烤箱（GFL-230，天津市莱玻瑞仪器设备有限公司）；冷冻切片机（CRYOSTAR NX50，赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；正置光学显微镜（Eclipse E100，日本尼康）；成像系统（DS-U3，日本尼康）；全景切片扫描仪（PANNORAMIC DESIK/MIDI/250/1000，3DHISTECH Hungary）；多功能酶标仪（Infinite M200，Tecan）。

1.2 药物与试剂

中药复方提取物（天津中医药大学教育部工程研究中心制备）；卡波姆（20230710012，安徽纽曼精细化工有限公司）；海藻酸钠（S11053，上海源叶生物科技有限公司）；羟丙甲纤维素（210212，安徽山河药用辅料股份有限公司）；羧甲基纤维素钠（S14014，上海源叶生物科技有限公司）；环保型脱蜡液（G1128，Servicebio）；通用性组织固定液（G1101，Servicebio）；苏木素-伊红（HE）高清恒染试剂盒（G1076，Servicebio）；中性树胶（10004160，国药集团化学试剂有限公司）；煤焦油（MFCD00146482，阿法埃莎（中国）化学有限公司）；维A酸乳膏（0.05%，重庆华邦制药有限公司）；兔肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒（MM-024001，江苏酶免实业有限公司）；兔白细胞介素-6（IL-6）ELISA试剂盒（MM-030201，江苏酶免实业有限公司）；兔白细胞介素-1β（IL-1β）ELISA试剂盒（MM-030501，江苏酶免实业有限公司）；2，4-二硝基氯苯（DNCB）（上海阿拉丁股份科技有限公司）。

1.3 动物

6~8周龄雄性新西兰白兔68只，购于天津市裕达实验动物养殖有限公司生产许可证号：SCXK（津）2021-0001；6~8周龄健康豚鼠30只，购于天津市裕达实验动物养殖有限公司生产许可证号：SCXK（津）2021-0001；所有动物实验经天津中医药大学实验动物伦理委员会审核批准，批准编号：新西兰兔TCM-LAEC2024111y1613，豚鼠TCM-LAEC2024112t1127，且实验均按相关指导原则和规定进行。

1.4 方法 1.4.1 复方中药痤疮凝胶的制备工艺 1.4.1.1 凝胶基质的选择

凝胶基质是决定制剂理化特性和药物疗效的关键因素，目前痤疮凝胶较为常用的基质材料包括卡波姆、海藻酸钠、羟丙基纤维素钠、羧甲基纤维素钠等^[7]。其中，卡波姆属于合成高分子化合物，其pH响应性使其在中和作用下生成透明弹性凝胶；海藻酸钠作为天然多糖类物质，需通过钙离子螯合形成凝胶，生物相容性良好；羟丙基纤维素钠是水溶性纤维素衍生物，具备热可逆胶凝和黏膜黏附功能，低浓度即可成胶；羧甲基纤维素钠则通过水合作用增稠形成凝胶体系，具有成本低、耐离子性强的优势。

通过查阅文献，确定其用量^[8]，制备不同浓度凝胶基质：取卡波姆、海藻酸钠、羟丙基纤维素钠、羧甲基纤维素钠适量，分别置于烧杯中，加入纯化水使其溶胀充分，分别配置成卡波姆（0.5%、1%）、海藻酸钠（1%、2%）、羟丙基纤维素钠（2%、4%）、羧甲基纤维素钠（2%、4%）的凝胶溶液，观察各凝胶情况。

1.4.1.2 药物的加入及混合成型实验

称取处方量药材，加入药材总质量12倍量的体积分数为70%的乙醇水溶液进行回流提取，提取3次，每次2 h，合并3次提取液，5 000 r/min。离心10 min，离心半径30 cm，取上清液进行喷雾干燥，进风温度130 ℃，出风温度70 ℃，蠕动泵流速10 mL/min，制备中药提取物喷干粉；将中药提取物分别加入到上述凝胶基质中，加入保湿剂甘油、辅助保湿剂丙二醇与防腐剂苯氧乙醇等，搅拌均匀，再加入适量三乙醇胺，调节pH值至6，观察结果。将中药提取物分别加入到上述凝胶基质中，观察结果。

1.4.1.3 评价标准

参照文献[9]标准检测程序，通过宏观表征（外观性状、涂展性、黏稠度）、物理稳定性（耐热、耐寒）及机械稳定性（离心实验）3个维度对制剂进行综合评价。见表 1。

1.4.1.4 正交法优化凝胶剂处方

以卡波姆-940、甘油、丙二醇的用量作为因素，进行三因素三水平正交试验，按“1.4.1.3”项下标准进行评分，试验设计见表 2。

1.4.1.5 工艺验证试验

采用优化后的处方制备3批凝胶样品，按“1.4.1.3”项下标准进行综合评价，验证最佳工艺是否可行。

1.4.2 复方中药痤疮凝胶药效学评价 1.4.2.1 适应性饲养

44只新西兰白兔单只分笼饲养，避免抓咬撕挠，损坏兔耳。于天津中医药大学动物中心适应性饲养7 d后开始进行实验，温度18~25 ℃，湿度35%~40%，饲以兔粮，自由饮水，自由饮食。

1.4.2.2 兔耳痤疮模型的建立

采用Kligman法进行造模^[10]，在新西兰兔右耳道开口内侧2 cm×2 cm区域每日均匀涂抹0.5 mL 2%煤焦油乙醇溶液（95%乙醇配制），连续干预14 d建立模型，左耳不做处理。实验周期结束后，观察记录皮肤损伤特征及毛囊角栓形成情况。随机选取2只实验兔，采集双侧耳道开口处全层皮肤组织，经4%多聚甲醛固定、梯度脱水后行常规石蜡包埋切片，通过HE染色技术进行组织病理学分析，评估模型构建是否成功。

1.4.2.3 分组及处理

44只新西兰白兔在适应性饲养1周后全数存活，随机抽取6只作为空白组，其余38只实验兔进行兔耳痤疮模型造模。造模结束后，随机抽取2只验证造模是否成功。待造模成功后，将剩余的36只实验兔随机分成6组，分别为：模型组、阳性药组、痤疮凝胶低剂量组（0.1 g/g）、痤疮凝胶中剂量组（0.2 g/g）、痤疮凝胶高剂量组（0.4 g/g）。给药组及阳性药组涂抹对应药物1g/（只·d），连续涂抹14 d，空白组及模型组不做处理。

1.4.2.4 样本采集与保存

实验结束后，新西兰白兔耳缘静脉取血5 mL，室温静置待凝，4 ℃ 3 000 r/min，离心20 min（离心半径14.5 cm）取上清，-80 ℃保存。取血后，静脉空气栓塞处死家兔，使用10 mm直径活检环钻获取其耳道口处全层皮肤，4%多聚甲醛固定。

1.4.2.5 病理形态学检查

将“1.4.1.4”样本经石蜡包埋处理后，制备连续切片，经HE染色后使用中性树胶封固，进行显微形态学观察。

1.4.2.6 血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平测定

取“1.4.1.4”血清样品，采用ELISA试剂盒对兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量进行测定。

1.4.2.7 统计与绘图

实验数据采用SPSS 27软件进行单因素方差分析，Origin 2018绘图。

1.4.3 皮肤刺激性研究 1.4.3.1 适应性饲养

24只新西兰白兔单只分笼饲养，避免抓咬撕挠，损坏兔耳。于天津中医药大学动物中心适应性饲养7 d后进行实验，温度18~25 ℃，湿度35%~40%，饲以兔粮，自由饮水、饮食。

1.4.3.2 分组及处理

24只新西兰兔随机平均分为单次给药组、多次给药组，组内分别随机平均分为完整皮肤组、破损皮肤组，每组6只。

实验兔于脊柱双侧对称区域建立3 cm×4 cm2脱毛模型，其中完整皮肤组通过化学脱毛维持表皮完整性，破损皮肤组采用手术刀片构建#形网格化表皮屏障损伤模型。给药区域以左、右分为实验侧与对照侧，分别涂抹0.5 mL复方中药痤疮凝胶及等量空白基质，采用无菌纱布-防水蜡纸-低敏胶带三重封闭敷贴4 h。单次给药组于清除药物后1、24、48、72 h动态监测皮肤反应，重复给药组连续干预7 d后同步观察。

1.4.3.3 评价标准

依据《中药、天然药物局部刺激性和溶血性研究技术指导原则》，按表 3对皮肤刺激强度评分，并通过积分均值按表 4判断皮肤刺激强度。

1.4.4 皮肤致敏性研究 1.4.4.1 适应性饲养

30只豚鼠分笼饲养，每笼5只。于天津中医药大学动物中心适应性饲养7 d后开始进行实验，温度18~25 ℃，湿度40~45%，饲以豚鼠专用饲料，自由饮水，自由饮食。

1.4.4.2 分组及处理

30只豚鼠随机平均分为空白对照组、实验组及阳性对照组，每组10只。致敏阶段：各组左侧背部脱毛（3×4）cm2后，分别单次敷贴0.5 mL空白基质、0.5 mL痤疮凝胶、0.2 mL 1% DNCB溶液，封闭固定6 h后清除药物，按照0、7、14 d的时间节点，连续进行3次致敏干预。激发阶段：末次致敏14 d后（即首次干预后第28 d），于右侧对称区域脱毛，次日施加对应受试物（0.5 mL空白基质/0.5 mL痤疮凝胶/0.2 mL 0.2% DNCB溶液），封闭固定6 h后清除药物。

1.4.4.3 评价标准

若实验组动物皮肤刺激评分≥2分，则判定为阳性，参照表 5、表 6评估凝胶剂致敏强度，参照公式“1-1”计算致敏发生率。

$ \begin{aligned}& \qquad \text{致敏发生率=皮肤红斑、水肿或全身过敏反应}\\ & \text{的动物数/受试动物×100%}\end{aligned} $

(1-1)

2 结果 2.1 复方中药痤疮凝胶的制备工艺 2.1.1 凝胶基质的选择

实验结果显示，卡波姆、海藻酸钠、羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素钠均能形成凝胶，但凝胶性状及特点存在差异，具体见表 7。结合用药部位等因素，考虑采用评分最高的0.5%卡波姆进行后续实验。

2.1.2 正交法优化凝胶剂处方

结果表明，卡波姆、甘油及丙二醇的用量对制剂综合评分均具有显著影响（P < 0.05），其影响从大到小依次为A>B>C>D，其中A2B2C2组（卡波姆3 g-甘油37.5 g-丙二醇75 g）综合评分最高。见表 8、表 9。

2.1.3 工艺验证试验

如表 10所示，按“2.1.2”项下最佳工艺制得的凝胶样品表面光滑透明、无杂质、质地均匀，易均匀涂展、黏度佳，离心稳定性与耐热、耐寒稳定性均良好，3批次样品的平均评分为48.8。

2.2 复方中药痤疮凝胶药效学评价 2.2.1 兔耳痤疮模型验证

正常兔耳表皮组织呈现典型生理特征：表皮厚度较薄，表面呈光洁的淡粉白色并具有良好透光性，见图 1A；造模3 d后，毛囊孔径逐渐扩张并伴随表皮角化异常，至实验周期结束时，表皮显著增厚并形成毛囊脂质栓，触感粗糙，机械挤压可见白色角化碎屑及黑色脂质栓排出，见图 1B。电镜下观察，正常兔耳可见表皮细胞有序排列，角质层结构完整，毛囊开口维持正常孔径，各皮层间分界明确，见图 1C，造模组角质层增厚明显，毛囊腔内充满角化栓塞物，毛囊壁增厚伴淋巴细胞浸润，棘细胞层体积增大且数量显著增多，见图 1D，其病理改变符合痤疮模型建立标准^[11]。

2.2.2 直观观察

给药结束后观察可见：正常兔耳呈均匀淡粉白色，表面较为光滑，无角化物质积聚或毛囊阻塞现象，见图 2A；模型组兔耳毛孔粗大，皮肤角化严重且增厚明显，毛囊口堵塞较多黑色角栓物质，粉刺状颗粒物增多，见图 2B；阳性药组兔耳柔软轻薄，粉刺状颗粒物消失，毛囊口明显缩小，见图 2C；痤疮凝胶低剂量组兔耳硬度减小，但仍有散在颗粒物，毛囊口扩张尚未得到有效控制，见图 2D；痤疮凝胶中剂量组兔耳增厚现象好转，毛囊口收缩，粉刺状颗粒物减少，见图 2E；痤疮凝胶高剂量组兔耳状态接近阳性药组，质地柔软，毛囊口无明显堵塞，无粉刺状颗粒物残留，见图 2F。与模型组相比，各给药组兔耳肿胀程度均有所减轻，增厚现象得到不同程度改善，其中阳性药组与痤疮凝胶高、中剂量组的改善效果更为显著。

2.2.3 兔耳切片染色

结果表明，空白组，如图 3A所示，兔耳组织整体结构基本正常，纤维组织排列规则紧密，大小较均匀，组织内未见明显的炎症细胞浸润。模型组，如图 3B所示，组织整体结构异常，广泛存在淋巴细胞和嗜酸性粒细胞等炎症细胞浸润（红色箭头），皮层增厚明显（灰色箭头），皮突延长，下端增宽与邻近皮突融合或交织，形成不规则的空腔，腔内可见角化物（蓝色箭头）；真皮层皮肤附属器毛囊及皮脂腺等数量少，灶性结缔组织增生（绿色箭头）。阳性药组，如图 3C所示，纤维局灶性表皮轻微增厚（灰色箭头），组织内可见少量的淋巴细胞浸润（红色箭头）。痤疮凝胶低剂量组，如图 3D所示，其表现出部分表皮增厚（灰色箭头），皮脂腺增大，数量增加，簇拥在毛囊周围（黄色箭头）。痤疮凝胶中剂量组，如图 3E所示，皮肤表皮结构清晰，少量粒细胞浸润（红色箭头）；痤疮凝胶高剂量组，如图 3F所示，少量灶性结缔组织增生（绿色箭头），胶原纤维与成纤维细胞交错排列，少量粒细胞浸润（红色箭头）。

与模型组（图 3B）相比，各给药组炎症细胞浸润情况有较大改善，毛囊壁角化、鳞状上皮增生等情况均有好转；与阳性药组（图 3C）相比，痤疮凝胶中剂量组（图 3E）、痤疮凝胶高剂量组（图 3F）与之效果较为接近，肉眼观察无显著差异。

2.2.4 血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平

如图 4-6所示，与空白组相比，模型组的TNF-α、IL-1β和IL-6的水平均明显增加。与模型组相比，各给药组血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均有所下降，差异具有显著性（P < 0.05），说明各组药物对兔耳痤疮均有一定治疗作用。与阳性药组相比，本处方痤疮凝胶各剂量组血清中的炎症因子水平与之接近，且无显著性差异。

2.3 皮肤刺激性研究

结果显示，在各个观察时间点新西兰兔均未见异常反应，未出现红斑、水肿现象，未出现死亡状况。皮肤状态见表 11、图 7、图 8。表明本凝胶无刺激性。

2.4 皮肤致敏性研究

结果表明（如表 12、9所示），阳性对照组豚鼠皮肤出现典型过敏反应，0~72 h内致敏发生率为100%，复方中药凝胶组和空白对照组致敏反应评分均为0，致敏发生率均为0%，表明本凝胶无致敏性。

3 讨论

痤疮是一种由多因素共同作用的慢性炎症性皮肤病，其发病机制尚未被阐明，目前普遍认为其始于雄激素水平升高或毛囊皮脂腺单位对雄激素敏感性增强^[12]，刺激皮脂腺过度分泌角鲨烯和蜡酯等脂质^[13]，同时，毛囊导管角质形成细胞异常增殖与分化，导致毛囊角化过度及微粉刺形成^[14-15]。在此闭塞环境中，痤疮丙酸杆菌利用皮脂中的三酰甘油作为营养源大量增殖^[16]，通过TLR2/4受体激活固有免疫系统^[17]，并分泌胞外多糖形成生物膜，进一步加剧毛囊堵塞^[18]。细菌代谢产物，如丙酸、卟啉等，及细胞壁成分刺激角质形成细胞释放IL-1α、IL-6、TNF-α等促炎因子，引发中性粒细胞浸润与毛囊周围炎症爆发^[19]，这一过程往往伴随着氧化应激的增强，最终导致毛囊壁破裂，脂质、角蛋白及细菌进入真皮层^[20]，激活基质金属蛋白酶（MMPs）破坏胶原纤维，形成炎性丘疹、脓疱甚至结节囊肿^[21-22]。慢性炎症还可通过NF-κB信号通路持续放大免疫反应，促使瘢痕形成^[23]。遗传易感性、高糖饮食及环境压力等因素通过调节mTORC1通路或改变皮肤微生物组构成，进一步影响病程进展^[24]。值得注意的是，这一病理过程并非线性进行，而是存在多个相互促进的反馈循环，例如炎症本身会进一步加剧毛囊角化异常，而屏障功能的破坏又为微生物定殖和炎症扩散创造了条件。虽然现代医学通过抑制皮脂分泌（如异维A酸）、抗菌（如过氧化苯甲酰）或抗炎（如多西环素）等单一靶点治疗取得一定效果^[25]，但长期应用易导致皮肤屏障受损、耐药菌株增加等副作用^[26]，同时，这种“单一靶点”的策略有时难以完全截断炎症网络的多向信号传导，且可能忽视皮肤局部微生态的整体平衡，且这种治疗策略对于中重度或顽固性痤疮而言，疗效往往难以持久，对预防炎症后色素沉着和瘢痕的效果也较为有限。而中药外治作为治疗痤疮的重要手段，具有疗效迅速、安全稳定、简便易行等特点。其在抑制致病菌的同时，能够兼顾抗炎、调节角化、甚至促进修复。这种更贴近痤疮多环节发病的治疗策略，使其近年来受到广泛关注^[27]。

通过对不同基质凝胶的多维度综合评价，确定采用卡波姆940作为基质，卡波姆的三维网络结构能有效承载中药成分，并可能在皮肤表面形成保湿膜，为活性成分发挥作用提供适宜环境。相较于海藻酸钠、羟丙甲纤维素及羧甲基纤维素钠，卡波姆940表现出更优的粘稠度与稳定性，可能与其pH响应性凝胶化、三维网络结构有关^[28-29]。基质种类确定后，通过正交试验对凝胶制备过程中卡波姆、甘油与丙二醇的加入量进行考察，得出最佳工艺，最后通过工艺验证实验对最佳工艺的稳定性和可操作性进行考察，结果表明，本工艺操作简单可行，稳定性良好。通过兔耳痤疮模型药效学验证，本凝胶展现出的治疗效果显著。本凝胶可改善兔耳痤疮模型导致的组织结构异常，改善炎症细胞浸润、毛囊壁角化、鳞状上皮细胞增生等情况；抑制痤疮导致的兔血清中TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子异常增多，效果与维A酸乳膏无显著差异（P>0.05），同时，各组组织结构异常及炎症因子水平升高等情况随给药剂量增大而逐渐减轻。皮肤刺激性与致敏性研究结果显示，本凝胶无刺激性、致敏性，安全性良好。这为外用制剂长期使用的安全性提供了重要支持，是区别于部分化学药物刺激性的关键优势。

研究基于中医“清热化瘀”理论构建的复方凝胶，制备工艺简单，对痤疮具有治疗作用，其作用机制可能与抑制TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子水平相关。本研究成功将中医理论指导下的处方转化为具有明确现代药效学证据的外用制剂，是中医药现代化的一次有益实践，但仍存在一定局限：一方面，凝胶具体的作用靶点与信号通路尚未深入揭示；另一方面，长期应用对皮肤微生态的潜在影响也有待考察。期待后续对本凝胶所涉及的靶点、信号通路等进一步阐明，同时，进一步完善本凝胶的质量标准，为临床应用提供保障。