2026, Vol. 45文章信息
- 戎薪夷, 王益民, 孙海丽, 吕春晓, 黄宇虹
- RONG Xinyi, WANG Yimin, SUN Haili, LYU Chunxiao, HUANG Yuhong
- BN大鼠和RBL-2H3细胞体内外实验评价丹红注射液致敏性风险
- Evaluation of the sensitization risk of Danhong Injection based on in vivo and in vitro experiments using BN rats and RBL-2H3 cells
- 天津中医药大学学报, 2026, 45(3): 308-316
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2026, 45(3): 308-316
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2026.03.08
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文章历史
收稿日期: 2025-09-26
引用本文 |
2. 天津中医药大学, 天津 301617;
3. 山东步长制药股份有限公司, 菏泽 274000;
4. 北京卓越未来国际医药科技发展有限公司, 北京 100176
2. Tianjin University of Chinese Medicine, Tianjin 301617, China;
3. Shandong BCI Pharmaceutical Co. LTD., Heze 274000, China;
4. Beijing Zhuoyue Future International Pharmaceutical Technology Development Co. LTD., Beijing 100176, China
中药注射液作为传统中医药理论与现代制药技术结合的产物，在临床治疗中因其起效迅速、生物利用度高等特点，广泛应用于心脑血管疾病、感染性疾病等急重症领域[1]。然而，随着其临床应用范围的扩大，中药注射液的安全性问题逐渐凸显，尤其是由药物成分复杂性和制备工艺差异性引发的过敏与类过敏反应，这已成为制约中药注射液临床推广的关键瓶颈[2]。近年来国内外研究报道显示，中药注射液可能导致以皮疹、呼吸困难、过敏性休克等为表现的过敏或类过敏反应，严重威胁患者用药安全[3]。值得注意的是，免疫球蛋白E（IgE）介导过敏反应与类过敏反应（非IgE介导）虽机制不同，但均可导致组织损伤甚至危及生命。
丹红注射液作为典型的中药复方制剂，由丹参、红花两味药材提取精制而成，具有活血化瘀、通脉舒络的功效，临床常用于冠心病、脑梗死等疾病的辅助治疗，疗效显著[4]。活血化瘀类中药制剂在临床上不良发生概率较高[5]，而丹红注射液是临床上使用较为广泛的是活血化瘀类中药注射液，其使用安全性十分值得关注。因此本研究以丹红注射液为研究对象，通过整合体外细胞模型如[大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞（RBL-2H3）细胞脱颗粒实验]及体内动物模型（如BN大鼠主动全身过敏实验）[6-7]，系统解析丹红注射液致敏风险，旨在评估丹红注射液整体安全性。
1 材料与仪器 1.1 细胞大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞系（RBL-2H3）（购自武汉普诺赛生命科技有限公司）用含15%胎牛血清（FBS）、1%双抗的含非必须氨基酸的最低基本培养基（NEAA）。培养于37 ℃、5% 二氧化碳（CO2）的恒温培养箱中，每2~3天以1∶2或1∶4比例进行细胞传代，该传代周期可使细胞保持在对数生长期。
1.2 动物SPF级BN大鼠，雄性，体质量200~220 g，8~10周龄，购于北京斯贝福生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0010。该实验已通过天津中医药大学动物实验伦理审查，伦理编号：TCM-LAEC2023067。
1.3 药品和主要试剂丹红注射液（批号：22082028）由山东丹红制药有限公司提供；0.9%氯化钠注射液（批号：2210113405）、5%葡萄糖注射液（批号：2205251602）、10%葡萄糖注射液（批号：2209282001）、葡萄糖氯化钠注射液（批号：2208201909）均购自石家庄四药有限公司；乙腈（批号：A998-4）、甲醇（批号：A452-4）均购自美国Fisher公司；甲酸（批号：F112034）购自阿拉丁公司；蒸馏水购自香港屈臣氏有限公司。4%多聚甲醛（批号：23136688）购自Biosharp生物科技有限公司。
伊红染液（批号：20230216）、苏木素染液（批号：20230228）均购自北京中杉金桥生物科技有限公司；氨水（批号：20230228）购自国药集团化学试剂有限公司；酸性乙醇分化液（批号：20230225）、甲酸脱钙液（批号：20230310）均购自源叶生物；磷酸盐缓冲液（PBS）（批号：20230325）、中性树胶（批号：20230227）均购自北京索莱宝科技有限公司。
大鼠IgE酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（批号：ml003022-2）、大鼠β氨基己糖苷酶（β-Hex）试剂盒（批号：ml038039-2）、大鼠组胺（HIS）ELISA检测试剂盒（批号：ml002986-2）、大鼠类胰蛋白酶（TPS）ELISA试剂盒（批号：ml869115-2）均购自上海酶联生物科技有限公司。
1.4 仪器PB10 PH计（Sartorius公司）；Osmo310渗透压测定仪（英国YASN公司）；NanoZetasizer激光粒度分析仪（英国Malvern公司）；GWF-8JDS不溶性微粒分析仪（天河医疗公司）；XPE26十万分之一天平（瑞士Mettler Toledo仪器有限公司）；Waters AQUITY UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；AB Triple Quad 5500AB质谱仪（美国AB公司）；TecanSpar Spark多功能酶标（瑞士TECAN）。LEiCA TP -1020脱水机（徕卡仪器有限公司）；LEiCA HistoCore MULTICUT病理切片机（徕卡仪器有限公司）；ES500-1包埋机（金华市华速科技有限公司）；ES500-2C冻台（金华市华速科技有限公司）；ES500-3H组织摊片机（金华市华速科技有限公司）；BPG-9106A烤箱（上海一恒仪器有限公司）；80302-2101载玻片（江苏世泰实验器材有限公司）；10212432C盖玻片（江苏世泰实验器材有限公司）；OLYMPUS CKX43-LP显微镜（OLYMPUS）；3DHISTECH P250 FLASH全景扫片仪（3DHISTECH）。BPN-80CH CO2培养箱；DMI8荧光倒置显微镜（徕卡仪器有限公司）；HH-2数显恒温水浴锅（山东欧莱仪器有限公司）。
2 方法 2.1 理化性质检查丹红注射液说明书中“用法用量”描述为“每次20~40 mL，加入5%葡萄糖注射液或0.9%氯化钠注射液100~500 mL稀释后缓慢滴注，每日1~2次”。依据此临床用法用量，将2支（每支20 mL）丹红注射液分别加入0.9%氯化钠注射液（100、250、500 mL）、5%葡萄糖注射液（100、250、500 mL）、10%葡萄糖注射液（250 mL）、葡萄糖氯化钠注射液（250 mL）中，常温，混合摇匀待用。
丹红注射液与相应溶媒配伍所得溶液。于0、1、2、4、6、8 h取样，依次检查溶液颜色、pH值、渗透压、不溶性微粒、粒径及化合物含量。分析其稳定性。
2.2 超高效液相色谱-质谱联用法（UP LC-MS/MS）测量化合物含量根据“2.1”按照等比例进行丹红注射液配伍。
2.2.1 储备液配制分别取丹参素（DSS）1.75 mg、原儿茶醛（YECQ）1.98 mg、4-香豆酸（1-XDS）3.68 mg、迷迭香酸（MDXS）5.41 mg、丹酚酸B（DFSB）2.27 mg分别加入到1.711 5、1.972 08、3.668 96、5.307 21和2.192 82 mL的1%甲酸甲醇-水（50∶50）中制成1 mg/mL的标准品溶液。
2.2.2 标准曲线工作液及内标工作液的制备取储备液DSS 80 μL、MDXS 20 μL、YECQ 16 μL、4-XDS 12 μL、DFSB 40 μL依次加入到1 832 μL溶剂[1%甲酸甲醇-水（50∶50）]中，制成2 mL混合标准品（Ang/mL），标准曲线工作液A浓度由低到高依次是1%A、2%A、5%A、10%A、20%A、40%A、80%A、100%A。内标为250 μL[1 mg/mL氯霉素（LMS）]加1 750 μL溶剂制成125 μg/mL氯霉素的工作液。见表 1。
| ng/mL | |||||||||||||||||||||||||||||
| 待测物 | 工作液1 | 工作液2 | 工作液3 | 工作液4 | 工作液5 | 工作液6 | 工作液7 | 工作液8 | |||||||||||||||||||||
| DSS | 400 | 800 | 2 000 | 4 000 | 8 000 | 16 000 | 32 000 | 40 000 | |||||||||||||||||||||
| YECQ | 100 | 200 | 500 | 1 000 | 2 000 | 4 000 | 8 000 | 10 000 | |||||||||||||||||||||
| 4-XDS | 80 | 160 | 400 | 800 | 1 600 | 3 200 | 6 400 | 8 000 | |||||||||||||||||||||
| MDXS | 60 | 120 | 300 | 600 | 1 200 | 2 400 | 4 800 | 6 000 | |||||||||||||||||||||
| DFSB | 200 | 400 | 1 000 | 2 000 | 4 000 | 8 000 | 16 000 | 20 000 | |||||||||||||||||||||
沃特世超高效液相色谱C18柱（Waters AQUITY UPLC C18）（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），先锋TM预柱（VanGuardTM pre-Column）（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）保护柱；强洗弱洗流动相为0.1%甲酸水溶液（A1）和0.1%甲酸乙腈（B1）。流速0.3 mL/min；色谱柱柱温（30±5）℃，自动进样器保持10 ℃，进样量2 μL。见表 2。
| % | |||||||||||||||||||||||||||||
| 时间（min） | A | B | |||||||||||||||||||||||||||
| 初始 | 80.0 | 20.0 | |||||||||||||||||||||||||||
| 0.50 | 80.0 | 20.0 | |||||||||||||||||||||||||||
| 4.00 | 30.0 | 70.0 | |||||||||||||||||||||||||||
| 4.50 | 10.0 | 90.0 | |||||||||||||||||||||||||||
| 5.00 | 10.0 | 90.0 | |||||||||||||||||||||||||||
| 5.51 | 80.0 | 20.0 | |||||||||||||||||||||||||||
| 7.00 | 80.0 | 20.0 | |||||||||||||||||||||||||||
采用负离子-多反应检测扫描模式（MRM）。干燥气体为氮气；气帘气（CUR）压力为35 psi，加热器温度（TEM）为500 ℃，离子化电压（IS）为-4 500 V，喷雾气（GS1）为50 psi，辅助加热气（GS2）50 psi，碰撞气（CAD）压力为中等。见表 3。
| 化合物 | Q1质量（Da） | Q3质量（Da） | 碰撞能量（V） | 去簇电压（V） | 入口电压（V） | 碰撞池出口电压（V） |
| DSS | 197.100 | 135.000 | -22.00 | -60.00 | -10 | -14 |
| YECQ | 359.100 | 161.100 | -22.00 | -100.00 | -10 | -14 |
| 4-XDS | 136.900 | 108.000 | -30.00 | -100.00 | -10 | -14 |
| MDXS | 163.000 | 118.900 | -21.00 | -80.00 | -10 | -14 |
| DFSB | 321.100 | 152.100 | -23.00 | -100.00 | -10 | -14 |
| LMS | 717.300 | 519.200 | -24.00 | -40.00 | -10 | -14 |
分别取50 μL标准曲线工作液和50 μL内标（100 ng/mL氯霉素），混匀进样分析。
2.2.5.2 样本制备丹红注射液与溶媒注射液配伍稳定性研究。分别取丹红注射液与溶媒注射液配伍后0、1、2、4、6、8 h的溶液各20 μL，加入内标20 μL（125 μg/mL氯霉素），50%甲醇水（含0.1%的甲酸）960 μL，混匀。再取液体20 μL加入50%甲醇水（含0.1%的甲酸）980 μL，混匀后进样分析以测定丹红注射液与溶媒注射液配伍后0、1、2、4、6、8 h化合物含量稳定性。
2.3 体外细胞实验 2.3.1 RBL-2H3细胞脱颗粒实验设计RBL-2H3细胞以1.8×106个/孔接种到6孔板中，培养过夜。对照组每孔加入2 mL的MEM（含NEAA）基础培基，阳性对照组加入20 μg/mL C48/80，丹红注射液组依据临床使用说明设置低中高剂量（20、30、50 μL/mL），给药孵育1 h。后续进行细胞活力、甲苯胺蓝染色、细胞上清检测IgE、His、β-Hex、TPS释放量实验。
2.3.2 细胞活力实验RBL-2H3使用含1%PBS、15%FBS的MEM（含NEAA）培养基，于37 ℃、5%CO2的培养箱中进行培养。取处于对数生长期的细胞，以1×104个/孔接种到96孔板中，于培养箱中孵育过夜，另设调零组不接种细胞。丹红注射液根据设置20、30、50 μL/mL。
细胞活力=[（A实验组-A调零）/（A对照组-A调零）]×100%。
2.3.3 甲苯胺蓝染色观察RBL-2H3细胞形态变化RBL-2H3细胞使用含1%PBS、15%FBS的MEM（含NEAA）培养基，于37 ℃、5%CO2的培养箱中进行培养。取处于对数生长期的细胞，接种到6孔板中，于培养箱中孵育过夜。按照2.2方法进行分组给药，培养1 h后，吸走细胞上清，使用4%多聚甲醛溶液固定细胞，滴加甲苯胺蓝进行染色，于显微镜下观察并拍照。
2.3.4 RBL-2H3细胞上清IgE、His、β-Hex、TPS释放量测定RBL-2H3细胞根据2.2分组给药后，收集细胞上清培养液进行检测。按照说明书进行加样，设置标准孔、空白孔。标准孔和待测样品孔每孔加不同浓度的标准品50 μL，空白孔不进行加样，然后标准孔和待测样品孔加入100 μL的辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，用封板膜封住孔板，37 ℃恒温箱温育60 min。而后弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350 μL），静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃恒温箱温育15 min。每孔加入终止液50 μL，15 min内在450 nm波长处测定各孔OD值。
2.4 体内评价实验 2.4.1 给药剂量设计丹红注射液采用4 mL临床剂量，以成年人60 kg为计算，为0.067 mL/kg，利用大鼠与人体剂量等效系数6.2进行换算，大鼠的给药量为0.415 4 mL/kg。丹红注射液4 mL，临床的稀释比例为1∶2.5（0.9%氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液稀释），丹红注射液在0.9%氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液中的体积比为0.286 mL/mL。用0.415 4 mL/kg除以0.286 mL/mL，大鼠的给药体积为1.45 mL/kg。
2.4.2 BN大鼠致敏性实验设计依据丹红注射液体外实验研究，设置阴性对照组（1.45 mL/kg生理盐水）、阳性对照组（1.45 mL/kg的卵白蛋溶液）、丹红注射液（0.145 mL/100 g）+0.9%氯化钠注射液组（丹红氯化钠组）、丹红注射液+5%葡萄糖注射液组（丹红葡萄糖组）。BN大鼠全身主动过敏实验主要包括致敏阶段和激发阶段（剂量为致敏阶段给药量的2倍）。首先进行致敏阶段给药，采取腹腔内给药，隔日致敏，一共致敏3次；于最后1次致敏后14 d，进行第1次激发实验，观察30 min，记录大鼠过敏形态变化，随后进行眼静脉丛取血，最后观察3 h后结束；致敏后21 d进行第2次激发实验，操作均同于第1次激发实验，第2次激发实验后，使用多聚甲醛对大鼠进行麻醉，而后解剖取出大鼠肺部组织，进行后续HE病理染色。
2.4.3 BN大鼠全身过敏反应症状及评价标准国家药品监督管理局通告2014第4号《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》里对过敏性实验方法项下的全身主动过敏实验的判断标准（0分：正常，1分：不安宁，2分：竖毛，3分：发抖，4分：搔鼻，5分：喷嚏，6分：咳嗽，7分：呼吸急促，8分：排尿，9分：排粪，10分：流泪，11分：呼吸困难，12分：哮鸣音，13分紫癜，14分：步态不稳，15分：跳跃，16分：喘息，17分：痉挛，18分：旋转，19分：潮式呼吸，20分：死亡）及评价标准，对大鼠激发后30 min内，观察BN大鼠的全身过敏反应症状评分并依据表 4全身致敏评价标准进行记录。
| 症状 | 评价标准 | 过敏反应判断 |
| 0分 | - | 过敏反应阴性 |
| 1~4分症状 | + | 过敏反应弱阳性 |
| 5~10分症状 | ++ | 过敏反应阳性 |
| 11~19分症状 | +++ | 过敏反应强阳性 |
| 20 | ++++ | 过敏反应极强阳性 |
BN大鼠根据2.3分组给药方式进行，收集大鼠血浆进行检测。按照说明书进行加样，设置标准孔、空白孔。标准孔和待测样品孔每孔加不同浓度的标准品50 μL，空白孔不进行加样，然后标准孔和待测样品孔加入100 μL的辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，用封板膜封住孔板，37 ℃恒温箱温育60 min。而后弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350 μL），静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃恒温箱温育15 min。每孔加入终止液50 μL，15 min内在450 nm波长处测定各孔OD值。
2.4.5 BN大鼠肺部病理学检查在致敏后21 d进行二次激发实验，观察30 min后，进行麻醉，解剖，摘取完整肺组织，用4%多聚甲醛进行固定48 h后进行包埋切片以及HE染色和显微镜观察。
3 统计学方法ELISA实验计算均以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算标准曲线直线回归方程，根据样品OD值由标曲算出相对应的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品实际浓度。各组实验数据使用SPSS 17.0软件进行统计分析处理。
4 结果 4.1 丹红注射液理化性质检测按照药典标准，丹红注射液与各溶液配伍后与标准色7号色黄色进行比对，丹红注射液与100 mL的0.9%氯化钠注射液、100 mL的5%葡萄糖注射液、10%葡萄糖注射液、葡萄糖氯化钠注射液配伍后颜色均深于7号色，0~8 h内均稳定。如图 1所示，丹红注射液标准要求丹红注射液pH值需在4.5~6.5之间，丹红注射液与各溶媒配伍后pH值均符合丹红注射液标准要求，且0~8 h内表现稳定。如图 2所示，丹红注射液渗透压0~8 h期间较为稳定无明显变化。注射液粒径要求为在人体可耐受范围内，即人体血管直径范围内，正常人体的毛细血管为6~9 μm。如图 3所示，丹红注射液0~8 h内，均在粒径合理范围内。
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| 图 1 丹红注射液与溶媒注射液配伍后0~8 h内溶液pH值 |
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| 图 2 丹红注射液与溶媒注射液配伍后0~ 8 h内溶液渗透压情况（mOsm/L） |
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| 图 3 丹红注射液与溶媒射液配伍后溶液0~8 h内粒径变化情况（x±s） |
参照《中国药典（2020版）》第4部规定：静脉注射用无菌粉末除另有规定外，每个供试品容器（份）中含10 μm及10 μm以上的微粒数不得过6 000粒，含25 μm及25 μm以上的微粒数不得过600粒。基于药典原则，如表 5所示，丹红注射液均符合药典要求，且0~8 h内无明显变化。
| 粒/mL | |||||||||||||||||||||||||||||
| 配伍 | 规格/支 | 粒径规格 | 0 h | 1 h | 2 h | 4 h | 6 h | 8 h | |||||||||||||||||||||
| 丹红注射液+ | 100 mL | ≥10 μm | 33.8 | 49.0 | 53.0 | 34.0 | 21.0 | 20.0 | |||||||||||||||||||||
| 0.9%氯化钠注射液 | ≥25 μm | 1.5 | 1.0 | 2.0 | 0 | 0.4 | 0.3 | ||||||||||||||||||||||
| 250 mL | ≥10 μm | 38.5 | 39.0 | 26.0 | 45.0 | 17.0 | 12.0 | ||||||||||||||||||||||
| ≥25 μm | 0.6 | 4.0 | 1.0 | 8.0 | 1.0 | 0.5 | |||||||||||||||||||||||
| 500 mL | ≥10 μm | 19.0 | 15.0 | 15.0 | 11.0 | 11.0 | 10.0 | ||||||||||||||||||||||
| ≥25 μm | 0.7 | 0.4 | 0.3 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | |||||||||||||||||||||||
| 丹红注射液+ | 100 mL | ≥10 μm | 43.9 | 34.5 | 35.5 | 28.1 | 27.0 | 36.8 | |||||||||||||||||||||
| 5%葡萄糖注射液 | ≥25 μm | 2.5 | 0.2 | 0.5 | 1.5 | 1.6 | 2.4 | ||||||||||||||||||||||
| 250 mL | ≥10 μm | 24.8 | 57.8 | 53.8 | 46.3 | 40.8 | 33.4 | ||||||||||||||||||||||
| ≥25 μm | 0.7 | 0.6 | 0.1 | 0.7 | 0.1 | 0.7 | |||||||||||||||||||||||
| 500 mL | ≥10 μm | 10.7 | 10.9 | 8.8 | 6.3 | 5.2 | 9.1 | ||||||||||||||||||||||
| ≥25 μm | 0.2 | 0.13 | 0.1 | 0 | 0.2 | 3.0 | |||||||||||||||||||||||
| 丹红注射液+ | 250 mL | ≥10 μm | 5.9 | 5.8 | 5.8 | 6.7 | 4.7 | 3.5 | |||||||||||||||||||||
| 10%葡萄糖注射液 | ≥25 μm | 0.7 | 1.2 | 0.7 | 1.0 | 0.8 | 0.2 | ||||||||||||||||||||||
| 丹红注射液+ | 250 mL | ≥10 μm | 53.8 | 58.3 | 47.0 | 40.4 | 54.5 | 46.6 | |||||||||||||||||||||
| 葡萄糖氯化钠注射液 | ≥25 μm | 0.4 | 3.6 | 1.5 | 1.3 | 3.2 | 3.2 | ||||||||||||||||||||||
丹红注射液其主要化合物成分为DSS、MDXS、YECQ、4-XDS、DFSB。因此《国家食品药品监督管理总局国家药品标准》对于丹红注射液化合物含量标准有明确要求，即：DSS不能低于0.8 mg/mL、MDXS不能低于0.1 mg/mL、YECQ不能低于0.1 mg/mL、4-XDS不能低于20 μg/mL、DFSB不能低于0.16 mg/mL。如图 4所示，丹红注射液与本实验选取各溶媒配伍后化合物含量均符合丹红注射液标准要求。
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| 图 4 丹红注射液与溶媒注射液配伍后0~8 h化合物含量（μg/mL） |
如图 5所示，各浓度给药后均未对细胞活力产生影响，细胞活力与药物浓度成反比，即药物浓度越低细胞活力越高。
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| 图 5 丹红注射液各浓度给药后RBL-2H3细胞活力（n=3） |
如图 6所示，经甲苯胺蓝染色后，阴性对照组RBL-2H3细胞呈现正常梭形结构，阳性对照组（C48/80组）较多细胞明显呈现圆形形态，且释放出大小不一的脱颗粒结构，丹红注射液组（20、30、50 μL/mL）可见到少量细胞呈现圆形形态。
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| 注：图a，阴性对照组；图b，阳性对照组；图c-e，丹红注射液组（20、30、50 μL/mL）。 图 6 丹红注射液各浓度给药后RBL-2H3细胞经甲苯胺蓝染色情况 |
如图 7所示，RBL-2H3细胞各组经给药后，在丹红注射液高中低剂量中，与阴性对照组相比，阳性对照组（C48/80组）、IgE（P < 0.01）、组胺（His）（P < 0.001）、类胰蛋白酶（TPS）（P < 0.001）、β氨基已糖苷酶（β-Hex）（P < 0.001）水平明显高于其他组；与阴性对照组相比，丹红注射液高浓度组（P < 0.05）His释放率显著升高；其他各组均无明显差异。
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| 注：与阴性对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。 图 7 各组给药后RBL-2H3细胞致敏实验IgE、His、β-Hex、TPS释放率（x±s，n=3） |
BN大鼠第1激发实验，大鼠形态学变化如表 6所示，阴性对照组全部表现为正常体态，无外在过敏反应体征，过敏反应为阴性。阳性对照组第1次激发后2只大鼠死亡，其余4只分别出现排尿、步态不稳、潮式呼吸等症状；丹红氯化钠组、丹红葡萄糖组均表现正常。BN大鼠第2次激发实验中，阴性对照组全部表现为正常体态，无外在过敏反应体征，过敏反应为阴性；阳性对照组第2次激发后2只大鼠死亡，其余2只分别出现旋转、喘息症状；丹红氯化钠组、丹红葡萄糖组均表现正常。
| 组别 | 动物数 | BN大鼠第1次激发实验 | BN大鼠第2次激发实验 | |||||||||
| - | + | ++ | +++ | ++++ | - | + | ++ | +++ | ++++ | |||
| 阴性对照组 | 6 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 阳性对照组 | 6 | 0 | 1 | 1 | 2 | 2 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | |
| 丹红氯化钠组 | 6 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 丹红葡萄糖组 | 6 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
如图 8所示，第1次激发实验后，与阴性对照组比较，阳性对照组His、β-Hex（P < 0.05）释放量显著升高；其他各组间无明显差异。
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| 注：与阴性对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。 图 8 BN大鼠两次激发实验后血浆中IgE、His，β-hex，Tps的水平（x±s，n=3） |
第2次激发实验后，与阴性对照组比较，阳性对照组His（P < 0.01）释放量显著升高；与阴性对照组相比，丹红氯化钠TPS释放量组显著降低（P < 0.05）。
4.4.3 BN大鼠组织病理切片情况如图 9所示，BN大鼠肺部组织病理切片在显微镜下观察显示，阳性对照组，切片均显示肺泡壁增厚，肺泡内有浆液渗出，且血管壁周围有散在的嗜酸粒细胞出现的情况。丹红氯化钠组和丹红葡萄糖组也出现了轻微的肺泡壁增厚的情况。
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| 注：图a，阴性对照组；图b，阳性对照组；图c，丹红氯化钠组；图d，丹红葡萄糖组。 图 9 BN大鼠两次激发结束后肺部组织病理切片情况 |
药理研究表明，丹红注射液改善微循环障碍方面具有独特临床价值，可通过抗血小板聚集、清除氧自由基等多靶点机制发挥血管保护作用[8]，但其作为成分复杂的中药注射剂，临床应用中存在引发过敏或类过敏等不良反应的风险[9]，因此本研究通过选用RBL-2H3细胞体外模型以及BN大鼠体内实验模型结合药物理化性质情况对丹红注射液的安全性进行评价。相关研究结论表明，BN大鼠较豚鼠等动物模型进行过敏反应实验，其组胺血清学指标检测能够更灵敏地反映动物的过敏反应[7]。RBL-2H3细胞系源于大鼠嗜碱性白血病细胞，已被广泛用作肥大细胞脱颗粒模型，近年来常用于进行药物致敏性研究[10]。
有研究发现，肥大细胞胞内存在一系列颗粒因子，当细胞受到刺激时，胞内物质将会释放出相关细胞因子，其中IgE通过与过敏原结合进而与肥大细胞表面IgE高亲和力受体（FcεRI）触发活化信号[11]，导致胞内颗粒释放。组胺作为肥大细胞颗粒内预存的主要生物胺，可迅速引发血管扩张及平滑肌收缩等急性过敏症状[12]，β-氨基己糖苷酶可以反映颗粒酶系的非特异性释放水平，而类胰蛋白酶作为肥大细胞特异性丝氨酸蛋白酶[13]，不仅参与细胞外基质降解和组织修复，还可通过激活蛋白酶激活受体（PARs）扩大炎症级联反应。这些介质的协同释放构成肥大细胞脱颗粒的生物效应网络。
实验从丹红注射液理化性质出发，分别考察丹红注射液动物和细胞体内外的形态学、脱颗粒因子的释放以及组织病理情况。从实验数据的分析可以看出，在制剂稳定性层面，丹红注射液与0.9%氯化钠及5%葡萄糖配伍后，各有效成分含量稳定且符合药典标准，这一发现与既往关于中药注射剂溶媒选择相吻合[14]。动物实验显示，丹红注射液未引发IgE水平升高及典型I型过敏反应病理改变，但细胞上清经ELISA实验发现丹红注射液高剂量组导致了细胞形态上的改变以及His释放量的升高。因此可以看出，丹红注射液自身稳定性较好，且不易在体内产生致敏反应。
研究通过多维度、多尺度的系统性评价，阐明了丹红注射液的安全性特征。综合看来，丹红注射液自身安全性较高，分子生物学层面致敏性较低。但过敏和类过敏等不良反应的发生，除了试剂本身因素外，还掺杂着患者个体化差异以及临床使用规范性等因素，建议丹红注射液或其同类制剂在临床规范使用前提下，平衡药物疗效与安全性[12]。最后，中药注射液的安全性评估应全面严谨综合考量，继续推动基于真实世界的药物上市后再评价研究，使中药注射液为临床上治疗相关疾病发挥最大效能。
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