丁公藤是旋花科植物丁公藤Erycibe obtusifolia Benth.或光叶丁公藤Erycibe schmidtii Craib的干燥藤茎，其性味辛、温，有小毒；归肝、脾、胃经^[1-2]，具有祛风除湿、消肿止痛功效。临床上多用其配制药酒，可以内服或外用，主治风湿痹痛、半身不遂、跌打损伤等^[3-4]。随着近年来对丁公藤药理研究的不断深入，证实丁公藤具有镇痛、抗炎的药理作用，在提高呼吸道免疫功能等方面也能够发挥积极作用^[5-7]。东莨菪苷与东莨菪内酯是丁公藤发挥镇痛、抗炎作用的关键活性成分^[8-11]，绿原酸具有抗肿瘤、抗病毒以及抗菌等多种生物活性^[12-14]。包公藤丙素在降低眼压方面具有显著药理价值^[15-16]。此外，丁公藤在中医临床应用中也占据重要地位，凭借其独特的药理作用，成为多种中医制剂的核心原料药^[17]。例如在临床常用中成药冯了性风湿跌打药酒中，丁公藤与其他中药协同作用，共同发挥祛风除湿、活血止痛的功效。由此可见，丁公藤的质量至关重要，它直接影响相关制剂在临床应用中的疗效，进而影响患者的生活质量。

目前报道的丁公藤质量评价方法多集中在东莨菪内酯和东莨菪苷两个化学成分^[18-19]，对于绿原酸类化合物以及其他活性成分的研究略有不足。中药的功效是多种成分共同发挥作用的，通过测定这些成分的含量，可以为中药材的质量评估提供依据。在当前中药质量评价体系背景下，多成分含量测定已经成为中药质量评价的有效手段^[20]，选择多成分含量测定更符合中药的质量控制标准。指纹图谱技术作为兼具整体性与可量化的分析手段，能够通过特征峰群关联分析有效评估中药品种真实性以及批次稳定性^[21-22]。故近年来两者联用呈现逐年上升趋势。在中药质量控制领域，构建科学且全面的质量评价体系对于保障中药材的质量稳定、确保临床用药的安全有效具有至关重要的意义。

本研究采用多指标含量测定与指纹图谱联用技术构建丁公藤质量控制体系。通过超高效液相色谱（UPLC）建立了30批不同产地的丁公藤指纹图谱分析方法，同时测定了丁公藤中9种成分的含量，系统考察不同批次间药材质量的均一性与稳定性，以期更全面、客观地对丁公藤药材质量标准提供方法学参考与数据支撑。

1 仪器与材料 1.1 仪器

UPLC仪（ACQUITY，美国沃特世公司）；万分之一天平（BP121S，德国赛多利斯公司）；十万分之一天平（MSA225P-0CE-DU，德国赛多利斯公司）；超纯水仪（Milli-QⅡ，美国密理博公司）；多功能粉碎机（RS-FS1411，中国荣事达电子电器有限公司）；离心机（Centrifuge5430R，德国艾本德公司）；超声波清洗机（XM-P22H，中国小美超声仪器有限公司）。

1.2 材料

新绿原酸对照品（批号：DST190124-015）、绿原酸对照品（批号：DSTDL002103）、东莨菪苷对照品（批号：DSTDD005601）、东莨菪内酯对照品（批号：DST231012-064）、黄芩苷对照品（批号：DSTDH002301）、染料木素对照品（批号：DSTDR000202）、异绿原酸A对照品（批号：DSTDY054703）、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品（批号：DSTDY003804）、异绿原酸B对照品（批号：DST240925-037），均购于成都德思特生物科技有限公司，纯度≥98%；甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；30批丁公藤药材中S1~S9产地广西壮族自治区、S10~S11产地云南省、S12~S18产地安徽省、S19~S30产地广东省，经天津中医药大学常艳旭教授鉴定为旋花科植物丁公藤Erycibe obtusifolia Benth.或光叶丁公藤Erycibe schmidtii Craib的干燥藤茎。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C₁₈（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脱（0~8 min，9%~9%B；8~16 min，9%~20%B；16~33 min，20%~30%B；33~34 min，30%~95%B）；检测波长：338 nm；流速：0.3 mL/min；柱温：37.5 ℃；进样量：2 μL。

2.2 供试品溶液制备

取适量丁公藤药材，粉碎，过50目标准筛（孔径300 μm）。精密称定丁公藤粉末0.75 g，转移至具塞锥形瓶中，加入25 mL 80%甲醇溶液，准确称定其总质量。将锥形瓶置于30 ℃水浴超声处理30 min，冷却室温，称取质量，80%甲醇溶液补足失去质量。所得溶液经14 000 r/min离心10 min（离心半径10 cm），0.22 μm微孔滤膜过滤，即得丁公藤供试品溶液，4 ℃冰箱保存。

2.3 对照品溶液制备

分别精密称定上述9种对照品适量，用甲醇溶解，制备得到不同浓度的单一对照品储备液。其中新绿原酸和东莨菪内酯的对照品母液浓度1.0 mg/mL；绿原酸、东莨菪苷、异绿原酸B和4，5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品母液浓度为5.0 mg/mL；异绿原酸A、黄芩苷和染料木素对照品母液浓度为2.0 mg/mL。精密吸取一定体积的各对照品母液，配制成含有以下终浓度的混合对照品溶液：新绿原酸150 μg/mL、绿原酸700 μg/mL、东莨菪苷800 μg/mL、东莨菪内酯150 μg/mL、异绿原酸B 250 μg/mL、异绿原酸A 150 μg/mL、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸450 μg/mL、黄芩苷150 μg/mL、染料木素200 μg/mL，置于4 ℃冰箱保存备用。

2.4 指纹图谱研究 2.4.1 指纹图谱建立

取30批丁公藤供试品溶液，按照上述色谱条件进样测定，将测定所得的30批丁公藤样品色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，选择样品编号为S1的色谱图作为参照图谱，时间窗参数设定为0.1 min，采用中位数法计算，经多点校正后进行全谱峰匹配分析^[23]。经过上述数据处理步骤，30批丁公藤指纹图谱共标识出12个共有指纹峰，并生成丁公藤叠加指纹图谱及对照指纹图谱，见图 1。通过与混合对照品溶液色谱图及保留时间进行比对，指认出9个色谱峰，分别为1号峰新绿原酸、2号峰绿原酸、3号峰东莨菪苷、4号峰东莨菪内酯、6号峰异绿原酸B、7号峰异绿原酸A、8号峰4，5-O-二咖啡酰奎宁酸、10号峰黄芩苷、12号峰染料木素，见图 2。

2.4.2 精密度实验

取适量丁公藤供试品溶液，按照上述色谱条件依次连续进样6次，记录色谱图，以2号绿原酸色谱峰为参照峰，通过计算得到其共有峰相对保留时间的相对标准偏差（RSD）值范围区间为0.259%~0.888%，相对峰面积的RSD值分布在0.927%~2.960%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性实验

精密称取适量丁公藤供试品粉末，按照“2.2”项下方法，平行制备6份独立供试品溶液，按照上述色谱条件进样分析，以2号绿原酸色谱峰为参照峰，通过计算得到其共有峰相对保留时间的RSD值范围为0.785%~1.430%，相对峰面积的RSD值分布在0.854%~2.720%，结果表明该方法重复性较好。

2.4.4 稳定性实验

取适量丁公藤供试品溶液，分别在供试品溶液制备完成后的0、2、4、8、12、24 h，按照上述色谱条件进样分析，以2号绿原酸色谱峰为参照峰，各共有峰的相对保留时间RSD值经计算可知范围为0.342%~0.760%，相对峰面积的RSD值分布在1.30%~3.33%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.5 指纹图谱评价

以分离度较好的2号绿原酸色谱峰作为参照峰，计算得到共有峰相对峰面积RSD值在28.6%~64.7%，说明不同批次的丁公藤药材在化学成分种类方面具有较高相似性，但在具体成分含量上存在一定差异。进一步通过叠加指纹图谱及对照指纹图谱进行相似度评价，30批丁公藤样品与对照图谱的相似度均高于0.947（表 1），表明所建立的指纹图谱方法稳定可靠，各批次药材质量一致性良好。

2.5 多成分含量测定方法建立 2.5.1 线性关系考察

精密移取“2.3”项下混合对照品储备液，采用80%甲醇溶液进行梯度稀释处理，得到不同浓度的混合对照品溶液，按照上述色谱条件进样测定。以质量浓度为横坐标（X），仪器测得的峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算得到9种成分的线性回归方程与线性范围（表 2），提示9种化学成分在各自线性范围内线性关系良好。

2.5.2 仪器精密度实验

取适量丁公藤供试品溶液，按照上述色谱条件依次连续进样测定6次，9种成分峰面积的RSD值分别为1.850%、0.926%、0.859%、1.900%、1.340%、0.887%、1.200%、1.680%、2.740%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性实验

取适量丁公藤供试品溶液，分别于制备完成的0、2、4、8、12、24 h，按照上述色谱条件进样，9种成分峰面积的RSD值分别为1.98%、1.47%、2.02%、1.91%、2.28%、2.09%、1.98%、3.04%、4.90%，表明供试品溶液在24 h放置期间内稳定性良好。

2.5.4 重复性实验

精密称取适量丁公藤供试品粉末，平行制备6份独立样本，按照上述色谱条件进样测定，9种成分含量的RSD值分别为1.56%、1.67%、3.12%、1.44%、3.35%、2.45%、2.29%、4.40%、4.64%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 加样回收率

精密称取适量丁公藤供试品粉末（样品编号为S1），并分别精密加入与样品含量1∶1比例的对照品，此操作平行6份，按照上述色谱条件进样测定，9种成分的平均加样回收率通过计算得到范围为95.3%~103.0%，RSD值分布在1.92%~3.85%，表明该检测方法准确度符合要求。

2.5.6 样品含量测定

取30批丁公藤供试品溶液适量，按照上述色谱条件依次进样测定，并记录每个色谱峰对应的峰面积，通过标准曲线分别计算30批丁公藤药材中新绿原酸、绿原酸、东莨菪苷、东莨菪内酯、异绿原酸B、异绿原酸A、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸、黄芩苷、染料木素的含量，结果见表 3。含量测定结果显示，30批丁公藤药材中9种化学成分含量存在一定差异（图 3）。东莨菪内酯作为《中华人民共和国药典》2020年版丁公藤指标成分，质量分数在不同产地中为0.19~2.05 mg/g，其中S3、S9、S26批次质量分数较高，S10、S28、S29批次质量分数较低。绿原酸、东莨菪苷含量差异在不同批次之间较大。不同产地丁公藤药材各成分含量差异较为明显，可能受到药材来源、种植条件、采收条件等因素差异影响。

3 讨论 3.1 提取方法优化

在实验前期，针对提取方法的关键参数开展了系统性考察工作。首先对不同提取方式进行了比较：超声提取相较于加热回流法而言，其提取效率的优势更为显著。进一步考察不同提取溶剂（70%甲醇、80%甲醇、100%甲醇）以及不同提取时间（15、30、45、60 min），结果表明80%甲醇超声提取30 min时，样品中各类成分能够实现较为充分的提取。此时色谱图中各色谱峰的峰面积较大，能够更加全面准确地反映药材的成分信息特征。基于以上结果，80%甲醇溶液超声处理30 min被确定为本实验的提取方法。

3.2 色谱条件的优化

在优化色谱条件时，对不同流动相体系（乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液）及梯度、不同检测波长（298、338、354 nm）、不同柱温（35、37.5 ℃）进行了系统性考察^[24]。经系统评价发现，当检测波长选择338 nm时，各化合物有较为理想的响应值；在乙腈-0.1%甲酸水溶液流动相体系，0.3 mL/min流速、37.5 ℃柱温条件，色谱峰形的对称性得到显著改善。最终确定最优分离条件为：乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相，流速0.3 mL/min，柱温37.5 ℃，检测波长338 nm。

3.3 结果分析

本实验通过建立的UPLC分析方法对30批丁公藤药材进行含量测定，结果表明30批丁公藤中9种目标成分含量的分布特征如下：新绿原酸、绿原酸、东莨菪苷、东莨菪内酯、异绿原酸B、异绿原酸A、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸、黄芩苷、染料木素的含量分别为0.22~2.17、1.76~14.89、1.18~11.63、0.19~2.05、0.89~3.80、1.07~4.18、1.65~5.10、0.24~2.15、0.21~2.54 mg/g。9种成分在30批丁公藤中含量差异较为显著，可能与药材产地、采收时间等因素密切相关。经方法学验证，该方法精密度、稳定性、重复性RSD均小于5.00%，加样回收率95.28%~103.33%（RSD＜3.85%），表明所建立的分析方法稳定可靠。

综上所述，本研究从UPLC指纹图谱与含量测定联用角度建立了丁公藤的质量评价方法，含量测定结果显示9种成分均存在一定差异，说明多指标成分的质量控制对丁公藤药材质量评价具有重要意义。基于该方法建立的化学特征图谱可以为药材种植基地选址、确定采收期及资源综合利用提供科学依据。

4 展望

目前，丁公藤植物资源面临枯竭。因其药理作用和临床应用，市场需求量依旧较大，研究其替代品可以减少对野生资源的依赖。但是现有很多丁公藤的混淆品扰乱市场，深入研究丁公藤活性成分及质量控制要求，可以明确丁公藤替代品的质量优劣，从而确保用药安全有效。因此，还需要不断地完善丁公藤的质量标准，并且建立规范化种植基地，确保原料质量稳定，同时促进生态保护。