近年来，中药天然产物的自组装（NPHM）^[1]技术受到了广泛关注，该技术利用中药活性成分的分子间作用力（如氢键、π-π堆积、静电相互作用等）形成纳米级递送系统，显著提高活性成分的溶解性、稳定性和生物利用度。通过中药天然产物的自组装，成功构建了一系列具有广泛生物活性的超分子材料，如凝胶和纳米颗粒^[2-7]，有效解决了中药活性成分在临床应用中的水溶性差、生物利用度有限以及稳定性低等问题，为纳米药物的开发和应用提供了全新思路^[8-9]。

葛根与甘草作为临床常用药对，常见于桂枝加葛根汤、葛根芩连汤等方剂^[10]，广泛用于治疗感冒、炎症、心血管疾病等。现代药理研究发现，葛根-甘草药对在多种疾病治疗中具有协同作用。例如，桂枝加葛根汤可以通过调节炎症因子水平改善风寒感冒及肩颈僵硬等症状^[11]；葛根芩连汤在抗菌、抗炎和治疗腹泻方面显示出显著效果，其机制可能与肠道菌群调控及抑制炎症因子表达有关^[12]。

葛根素（Pue）是从中药葛根中提取的一种C-苷型异黄酮，化学名为7，4’-二羟基-8-C-葡萄糖基异黄酮，分子式为C₂₁H₂₀O₉，分子量为416.38。其结构中包含多个酚羟基及1个通过C-C键连接的葡萄糖苷基，具备一定的亲水性；但Pue分子骨架以疏水性的苯并吡喃酮为主，整体呈现出较强的疏水性，导致其在水中溶解度极低（在25 ℃条件下约为0.46 mg/mL）^[13]。因此，葛根素的口服吸收效果不佳，生物利用度仅约7%，严重限制了其在临床中的应用^[14]。

甘草酸（GA）是从甘草中提取的一种天然三萜皂苷类化合物，呈弱酸性，可以溶于水（pKa₁=3.2，pKa₂=3.2，pKa₃=5.2），其分子式为C₄₂H₆₂O₁₆，分子量为822.93。GA的结构由1个齐墩果烷型五环三萜结构的甘草次酸母核与两个葡萄糖醛酸残基通过糖苷键连接而成，呈典型的两亲性结构：疏水的三萜骨架和亲水的糖基链段共存。由于其两亲性特征，GA能够自组装形成胶束或纳米结构，在水相中包载疏水性药物分子，提高其溶解性与稳定性^[15]。因此常被用作自组装药物递送系统载体以改善难溶性药物的溶解性。因而通过分子自组装技术构建Pue-GA自组装纳米药物，成为提高Pue溶解度和生物利用度的重要策略。已有研究表明，甘草成分能够显著影响Pue的体内行为，提高其生物利用度。研究发现GA可以通过抑制P-糖蛋白（P-gp）介导的外排作用，提高Pue在小肠的吸收，并延长其在体内的消除半衰期^[16]。Pue与GA配伍制备分散片，可以显著提高Pue的溶解度与体外溶出速率，从而改善其口服吸收并提高生物利用度^[17]。然而，Pue与GA在自组装过程中的相互作用机制及其对吸收过程的影响尚缺乏系统性的研究。特别是，不同比例配伍的Pue与GA在自组装纳米粒形成过程中所产生的结构变化及其对葛根素吸收机制的影响仍未得到研究。

基于此，本研究聚焦于葛根-甘草药对的主要活性成分（Pue与GA）在不同配比条件下制备的葛根素-甘草酸自组装纳米粒（Pue-GA NPs）在Caco-2细胞单层模型中的吸收与转运能力，系统评估其配伍比例对吸收转运效率的影响，为提高Pue的口服生物利用度提供理论依据，并为中药活性成分纳米载体的开发及其吸收机制研究提供理论支持和技术支撑。

1 仪器与材料 1.1 仪器与试剂

十万分之一天平（XP205，瑞士Mettler Toledo公司），膜电位仪（EVOM2，美国WPI公司），粒度与电位分析仪（Nano-ZS，英国Marlvern公司），高速搅拌仪（RW20，德国IKA集团），生物安全柜（美国THERMO FISHER公司），二氧化碳（CO₂）培养箱（Heracell BIOS 160i，美国THERMO公司），高效液相色谱仪（日本岛津公司，包括SPD-20A紫外监测器，LC-20AT泵）。DMEM培养基（不含谷氨酰酸，美国Gibco公司），磷酸缓冲盐溶液（PBS，北京索莱宝科技有限公司），胎牛血清（FBS，美国Gibco公司），青霉素和链霉素（双抗，美国Gibco公司），葛根素对照品（含量96.8%，110752-202217，中国食品药品检定研究院），GA对照品（含量95%，批号G13J11L115734，上海源叶生物科技有限公司），Pue原料药（含量95%，批号A12GS157424，上海源叶生物科技有限公司），GA原料药（含量95%，批号F24IS207835，上海源叶生物科技有限公司），盐酸氯丙嗪（CPZ，含量98%，批号RH489471，上海易恩化学技术有限公司），甲基-β-环糊精（M-β-CD，98%，批号J05GS150751，上海源叶生物科技有限公司），蔗糖（批号170103007D，南京化学试剂有限公司），EIPA（95%，批号JS270752，上海源叶生物科技有限公司），Hank’s Balanced Salt Solution（HBSS）溶液（批号24222383，北京兰杰柯科技有限公司），细胞培养瓶、24孔Transwell细胞培养板（美国Corning公司）。

1.2 实验细胞

Caco-2细胞株购自ATCC，本实验所用细胞为45~50代。细胞培养于含15% FBS、1%青霉素和链霉素的DMEM培养基中。置于37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱内培养，前7 d隔日换液，之后每日换液。

2 方法与结果 2.1 Pue-GA NPs的制备

精密称取Pue 4.16 mg，溶解于四氢呋喃；分别精密称取GA 4.12、8.23、16.46 mg，溶解于去离子水中，配制不同物质的量的GA水溶液。按照Pue与GA摩尔比为1∶0.5、1∶1、1∶2，将有机相缓慢匀速滴加至水相，滴加过程中保持搅拌。滴加完成后，将混合液在40 ℃、80 r/min条件下旋蒸至有机溶剂完全挥发。最终，将所得混合液通过0.45 μm微孔滤膜过滤，制备出摩尔比为1∶0.5、1∶1、1∶2的Pue-GA NPs。同时，按照相同方法，在不添加GA的条件下制备Pue NPs。

2.2 Pue-GA NPs的表征和理化性质 2.2.1 外观和形态观察

纳米粒的外观如图 1所示，其中Pue NPs呈无色，Pue-GA NPs表现为白色且伴有乳光，溶液整体清澈，未见明显浑浊或沉淀，显示出较好的分散性与均匀性。

取10 μL样品溶液于碳膜铜网上，静置10 min后将多余液体从铜网边缘除去，将3%醋酸双氧铀滴在铜网上，计时3 min后，用小片滤纸将多余染色液体吸走。待液体挥干后采用透射电子显微镜（TEM）拍摄其形态。TEM结果如图 2所示，TEM显示4种纳米粒均呈球形。

2.2.2 粒径及其分布

量取1 mL纳米混悬液，采用Nano-ZS纳米粒度仪测定粒径分布。粒径与粒径分布结果如图 3及表 1所示，结果显示4种纳米粒平均粒径均在120~190 nm，多分散指数（PDI）均小于0.15，粒径分布较均匀，分散性较好。结果表明，当Pue∶GA摩尔比为1∶1时，纳米粒的粒径最小，可能具有最佳的稳定性和功能特性。

2.2.3 紫外光谱特性

采用紫外-可见吸收光谱在200~500 nm对自组装纳米粒进行扫描，并与2种游离成分的光谱进行对比。结果如图 4所示，Pue-GA NPs的紫外-可见吸收光谱相比于单独的Pue（250.14 nm）和GA（258.48 nm）表现出明显的蓝移，吸收峰位置从长波长区域移动至249.58、247.74、248.94、249.49 nm。这一现象可能源于Pue与GA之间的相互作用（如氢键或π-π堆积作用），导致分子间的排列致密，从而限制了电子离域程度，增加了电子跃迁所需的能量，表现为吸收光谱向短波长方向移动。此外，Pue与GA复合形成纳米粒后，分子间的堆积与局部极性环境变化可能导致电子离域程度降低，从而增加了带隙能量，增强了对短波长光的吸收。同时，纳米颗粒的表面效应或界面效应可能改变了分子微环境，例如分子的极化或电子分布变化，也对蓝移起到了重要作用^[18]。这些结果表明，Pue与GA的协同作用可以调节其所形成纳米复合物的电子结构和光学性质，电子结构的变化可能影响复合物表面的电子密度和分子极性，增强其与细胞膜磷脂双分子层的相互作用能力，进而促进跨膜转运与细胞摄取。该机制提示Pue-GA自组装体系具有优化的理化特性，有利于提升其在细胞水平的膜穿透性能。

2.3 Pue-GA NPs的分子对接模拟

自组装纳米粒的分子对接作用是通过分子间非共价相互作用，自发形成特定功能和结构纳米材料的过程^[19]。采用分子对接技术，分析Pue-GA NPs组装过程中的分子间相互作用。PubChem数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/）下载Pue、GA的SDF文件。用OpenBabel-2.4.1将SDF文件转换为MOL2文件。AutoDock Tools 1.5.7优化小分子结构，利用软件AutoDock Vina 1.1.2进行分子对接，记录最低结合能，一般认为结合能越低，结合性越好，通常认为结合能低于0时，能够自发进行，且分子结合能小于-17.78 kJ/mol，分子与靶点有一定的结合活性；小于-23.01 kJ/mol，分子与靶点有较好的结合活性；小于-33.47 kJ/mol，分子与靶点的结合具有强烈活性。因此，选择结合自由能（G）最低的对接模型，作为最适合分子模拟的结合模型^[20]，并用PyMOL 2.5.7软件进行可视化处理。

结果如图 5和表 2所示，当不含GA时，Pue的G变化为-12.21 kcal/mol，表明结合过程可以自发进行。随着Pue∶GA比例增加至1∶0.5，G降至-31.28 kcal/mol，表明两者的结合活性显著增强。当Pue∶GA=1∶1时，G为-29.33 kcal/mol，仍显示出较强的结合能力。当Pue∶GA=1∶2时，G进一步降低至-38.99 kcal/mol，表明两者之间的相互作用更加稳定，结合活性更强。上述结果表明，不同比例（Pue∶GA）制备的Pue-GA NPs中均存在氢键作用，GA的存在对Pue与GA之间的结合能力具有显著影响，并且可能在特定比例下促进更稳定的复合物形成。

2.4 Pue-GA NPs在Caco-2单层细胞转运实验

将Caco-2细胞浓度调整至1×10⁵个/mL，接种于24孔Transwell小室中，顶端侧（AP）接种0.2 mL细胞悬液，BL侧（BL）接种1.3 mL完全培养基，于37 ℃、5% CO₂条件下持续培养21 d，每隔4 d传代1次，传代48 h内不能换液，隔日换液。当细胞生长至面积约占80%时，使用胰酶消化并传代。培养至第21天后，通过形态学观察及跨膜电阻测定对Caco-2细胞单层模型的完整性进行评价。结果显示，培养到21 d的Caco-2能分化形成整齐排列的微绒毛结构，跨膜电阻稳定在950~1 200 Ω·cm²之间，符合单层细胞模型要求^[21]，可以用于实验。

2.4.1 Pue-GA NPs的转运特性

实验前用预热至37 ℃、pH=6.8的HBSS溶液润洗AP和BL各两次，置于培养箱中平衡30 min，弃培养液。分别在AP加入用HBSS溶液稀释的Pue∶GA摩尔比为1∶1的物理混合物分散液以及纳米粒混悬液，BL加入空白HBSS溶液1.3 mL作为接收池。以上处理后将24孔transwell板置于细胞培养箱中，分别于30、60、90、120、150、180 min从接收池中取样200 μL，并对应补足同体积接收液。取出的样品以10 000 r/min离心3 min（离心半径16.8 cm），取上清液，高效液相色谱法测定Pue含量，依照公式（1）、（2），计算累积透过量（ΔQ）和表观渗透系数（P_app）。

$ \Delta Q=C_1 \times V_1+\sum\nolimits_{M=1}^{N-1} C_N \times V_2 $

(1)

$ P_{\text {app }}=\frac{\frac{d Q}{d t}}{\left(C_0 \times A\right)} $

(2)

其中C_N为第N个时间点所取样品的浓度（μg/mL），$\sum_{M=1}^{N-1} C_N $为第1个至第n-1个时间点所取样品浓度之和（μg/mL），C₀为药物初始浓度（μg/mL），V₁为药物接收端的体积（mL），V₂为各时间点的取样体积（mL），ΔQ为药物在Δt时间段内透过的量（μg），P_app的单位常用cm/s表示，A为细胞表面积，在本模型中支持膜面积（0.33 cm²）。

采用SPSS 26.0统计软件对实验结果进行分析处理，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用两独立样品t检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。

Pue-GA NPs（Pue∶GA=1∶1）在Caco-2细胞模型上的表观渗透系数见表 3。表 3结果显示，与物理混合物组（Pue∶GA的摩尔比为1∶1）相比，纳米粒组Pue的P_app值显著提高。结果表明，纳米技术可以改善Pue的渗透性和跨膜转运能力，这可能与纳米化能够通过减少药物粒径来增加药物溶解度以及“载体-药物相互作用”有关^[22]。

2.4.2 Pue-GA NPs中Pue的渗透能力与Pue∶GA配比的关系

同“2.4.1”项步骤。给药时，分别在AP加入用HBSS溶液稀释的Pue∶GA摩尔比为1∶0.5、1∶1、1∶2的Pue-GA NPs及Pue NPs，BL加入空白HBSS溶液1.3 mL作为接收池。取样操作、后处理及数据分析同“2.4.1”项。

不同摩尔比的Pue-GA NPs在Caco-2细胞模型上的表观渗透系数见表 4。实验结果显示，相较于Pue NPs组，Pue-GA NPs在1∶0.5、1∶1、1∶2摩尔比分组中的表观渗透系数分别提高了1.20、1.35和1.26倍，差异具有统计学意义（P < 0.01），表明GA的引入可以显著增强Pue的跨膜转运能力。

此外，不同摩尔比的Pue-GA NPs组之间也存在统计学差异（P < 0.05），其中1∶1组的表观渗透系数显著高于1∶0.5和1∶2组，提示在该摩尔比下GA对Pue跨膜转运的促进作用最为显著。该结果表明，不同摩尔比的GA在促进作用上存在差异，且Pue∶GA=1∶1的比例是一个关键点，在这一比例下，Pue和GA之间的相互作用达到了最优，从而显著增强了Pue的渗透能力。因此合理的药物配比是提高纳米粒性能的关键。通过优化药物配比，可以显著提升纳米粒载药系统的性能^[23]。

2.4.3 Pue-GA NPs（Pue∶GA=1∶1）在Caco-2细胞中的转运机制

实验前，用预热至37 ℃、pH=6.8的HBSS溶液[分4组，各加入30 μmol/L CPZ、0.4 mol/L高渗蔗糖（HS）、10 mmol/L甲基-β-环糊精（M-β-CD）、40 μmol/L EIPA]分别润洗AP和BL各两次，将细胞置于培养箱中平衡30 min，弃去培养液。随后，在AP加入用上述HBSS溶液稀释的Pue-GA NPs溶液（Pue与GA的摩尔比为1∶1）；BL加入1.3 mL空白HBSS溶液作为接收池。取样操作、后处理及数据分析同“2.4.1”项。

内吞抑制剂分别处理含Pue与GA的摩尔比为1∶1的Pue-GA NPs溶液的细胞30、60、90、120、150、180 min后，Pue与GA的摩尔比为1∶1的Pue-GA NPs在Caco-2细胞模型上的表观渗透系数见表 5。统计分析结果表明，各抑制剂处理组与未加抑制剂的对照组相比，P_app值均降低（P < 0.05），表明Pue-GA NPs的细胞摄取存在网格蛋白介导、小窝/脂阀蛋白介导和巨胞饮等多种途径。此外，不同抑制剂组间也存在统计学差异（P < 0.05），其中CPZ组的抑制效果最为显著，提示网格蛋白介导的内吞是Pue-GA NPs进入细胞的主要途径。其中网格蛋白介导的内吞是Pue-GA NPs摄取入胞的主要途径。这可能与Pue-GA NPs的粒径尺寸密切相关^[24-25]。

2.4.4 CPZ对不同摩尔比的Pue-GA NPs的影响

实验前，抑制剂组用预热至37 ℃、pH=6.8的HBSS（含30 μmol/L CPZ）溶液润洗AP和BL各两次，将细胞置于培养箱中平衡30 min，弃去培养液。在AP加入用上述HBSS溶液稀释的Pue-GA NPs溶液（Pue与GA的摩尔比为1∶1与1∶2）；BL加入1.3 mL空白HBSS溶液作为接收池。正常组则向AP加入以HBSS稀释的Pue-GA NPs（1∶1与1∶2）及Pue NPs溶液，BL同样加入1.3 mL空白HBSS。取样操作、后处理及数据分析同“2.4.1”项。

CPZ处理后，不同摩尔比Pue-GA NPs及Pue NPs在Caco-2细胞模型上的表观渗透系数见表 6。在无抑制剂条件下，Pue与GA的摩尔比为1∶1的Pue-GA NPs的P_app最高；加入CPZ后，其P_app低于Pue NPs和1∶2配比。这表明Pue∶GA=1∶1配比的纳米粒更依赖网格蛋白介导的内吞作用，CPZ抑制网格蛋白后导致P_app显著下降。

3 讨论

本研究采用溶剂挥发法制备Pue与GA摩尔比分别为1∶0.5、1∶1、1∶2的Pue-GA NPs及Pue NPs，所得到的纳米粒均呈现球形且形态均匀，其平均粒径在120~190 nm，PDI在0.09~0.15，稳定性好。为改善药物肠道吸收奠定基础。

在本研究中，系统探讨了Pue与GA不同配伍比例的自组装纳米粒在Caco-2细胞单层模型中的吸收转运特性。结果表明，相较于Pue与GA的物理混合物，自组装纳米粒显著提高了Pue在Caco-2细胞中的吸收效率。这表明纳米技术在提升难溶性药物跨膜转运能力方面具有重要作用^[26]。

不同配伍比例对纳米粒的理化性质及其在细胞模型中的行为产生了重要影响，揭示了分子间相互作用在纳米粒性能优化中的关键调控作用^[27]。GA的引入在提升Pue NPs吸收与转运效率方面发挥了关键作用，其机制可能包括通过减小纳米粒的粒径、增加纳米粒的稳定性以及调控细胞膜通透性，从而显著提高Pue的跨膜转运能力^[28-29]。其中，Pue∶GA=1∶1配比的纳米粒展现出最优的吸收转运效率。该结果可能与1∶1配比的纳米粒粒径较小且分布均匀有关，进而提升了其稳定性和跨膜内吞能力。Pue∶GA=1∶2配比的纳米粒，GA可能相对过量导致结构更致密、刚性增强，或引起包覆层空间构型变化干扰表面电荷的稳定性，从而降低其与细胞膜的相互作用能力，抑制纳米粒的有效内吞与跨膜摄取。同时，过量GA可能破坏自组装结构的动态平衡，降低纳米粒稳定性和膜融合能力。Pue NPs由于未引入GA形成自组装结构，粒径较大，亲水性差，胶体稳定性有限，难以实现与细胞膜的有效结合与内吞，因而表现出最低的跨膜转运能力。

通过进一步使用内吞抑制剂（CPZ、HS、M-β-CD和EIPA），明确了Pue-GA NPs（Pue∶GA=1∶1）主要通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞，小窝蛋白介导内吞和巨胞饮途径发挥协同作用。这可能与Pue-GA NPs（Pue∶GA=1∶1）的适中粒径和较高的结构稳定性密切相关，使其更适合通过网格蛋白介导的内吞途径进行跨膜转运。CPZ对不同配比Pue-GA NPs P_app的影响实验显示，Pue∶GA=1∶1配比纳米粒的P_app值下降最显著，低于Pue NPs及1∶2配比组，进一步证明其对网格蛋白介导的内吞途径依赖性更强。结合Pue∶GA=1∶1配比纳米粒的理化特性，推测其优化的粒径及分子间相互作用（如氢键和疏水作用）显著增强了其内吞适配性，从而促进了更高效的跨膜转运过程。

综上所述，本研究揭示了Pue与GA不同配伍比例对纳米粒性能和跨膜吸收能力的显著影响。Pue∶GA=1∶1配比的Pue-GA NPs在Caco-2细胞单层模型中的吸收转运效率最高，并通过网格蛋白介导的内吞机制实现药物高效递送。这一研究为开发高效中药纳米递送系统提供了重要的设计依据，并为提升难溶性中药成分的生物利用度提供了新思路。