炎症性肠病（IBD）作为一种慢性肠道免疫介导性疾病，以肠道黏膜持续炎症、溃疡形成及全身免疫紊乱为特征，临床治疗面临药物应答率有限、不良反应突出等挑战^[1]。中药复方因多靶点调控优势在炎症性疾病中展现潜力，固肠胶囊由诃子肉、罂粟壳等组成，中医临床用于脾胃虚弱型泄泻，广泛应用于临床肠易激综合征的治疗，而在IBD中的相关研究较少^[2]。长链非编码RNA（lncRNA）THRIL在炎症调控中扮演关键角色，其通过吸附微小RNA或调控蛋白复合体参与炎症级联反应，且在IBD模型中的表达水平与肠道炎症程度正相关^[3]。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）/核转录因子-κB（NF-κB）通路是炎症核心通路，p38MAPK激活促进促炎因子释放，NF-κB介导免疫细胞活化，两者协同驱动IBD肠道炎症进展^[4-6]。本研究通过葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导建立小鼠IBD模型，观察固肠胶囊对肠道炎症的干预作用，探讨其是否通过下调lncRNA THRIL表达、抑制p38MAPK/NF-κB通路活化减轻炎症反应，以期为该中药复方的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物

36只8~11周龄C57BL/6雄性小鼠（体质量20~25 g）购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2024-0003。饲养于温度（22±2）℃、相对湿度50%~60%、12 h光照/12 h黑暗交替的环境中，自由摄食及饮水。本研究的动物实验经天津医科大学总医院伦理委员会批准同理（批号：IRB2023-DW-129）。

1.1.2 实验药物

固肠胶囊（购自津药达仁堂集团股份有限公司，规格：0.375 g/粒，国药准字：Z20010168），将其研磨成粉末后，用生理盐水配制成1 mg/mL的混悬液；阳性对照药物：美沙拉嗪肠溶片（购自Losan Pharma GmbH，规格：0.25 g/片，批准文号：H20100261），用生理盐水配制成1 mg/mL溶液。

1.1.3 主要试剂及仪器

DSS（货号：0216011050，规格：50 g）购自安倍医疗器械贸易（上海）有限公司；TRIzol试剂（货号：15596026）购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒（货号：K1622）购自美国Fermentas公司；实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒（货号：4913914001）及蛋白酶抑制剂混合物（货号：11836170001）购自罗氏诊断产品（上海）有限公司；p38MAPK抗体（货号：9212S）、NF-κB p65抗体（货号：8242S）、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）抗体（货号：9211S）、磷酸化NF-κB p65（p-p65）抗体（货号：3033S）购自上海艾博抗贸易有限公司；电化学发光（ECL）发光液（货号：SHECL100）购自杭州申花科技有限公司；辛胆酸（BCA）蛋白定量试剂盒（货号：23225）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；CelLytic^TM细胞裂解缓冲液（货号：C2978）购自美国Sigma-Aldrich公司；小鼠酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒：肿瘤坏死因子-α（TNF-α，货号：JL10484）、白细胞介素-6（IL-6，货号：JL20268）、白细胞介素-4（IL-4，货号：JL20266）、白细胞介素-10（IL-10，货号：JL20242）和白细胞介素-1β（IL-1β，货号：JL18442）购自上海江莱生物科技有限公司。

qRT-PCR仪（型号：7500 Fast）及酶标仪（型号：Multiskan FC）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Trans-Blot Turbo^TM快速转印系统（型号：1704150）购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；光学显微镜（型号：BX53）购自奥林巴斯（中国）有限公司。

1.2 建模方法、分组及组织样本收集

将小鼠随机分为6组，每组6只，分别为对照组、模型组、固肠胶囊低剂量组、固肠胶囊中剂量组、固肠胶囊高剂量组和美沙拉嗪治疗的阳性对照组（美沙拉嗪组）。将DSS添加饮用水中至终浓度为4%（w/v），除对照组外其余各组小鼠连续7 d饮用4%DSS水溶液诱导IBD模型。小鼠出现食欲、体质量下降、精神萎靡、稀便等现象；造模第3天除对照组外，每组各随机选取3只小鼠，HE染色结果显示，与空白对照组比较，模型组隐窝畸形、杯状细胞减少、结肠腺体消失、黏膜层明显变薄、上皮损伤严重、肌层大量炎症细胞浸润。提示IBD模型构建成功。固肠胶囊低、中、高剂量组分别于造模开始第4天灌胃固肠胶囊混悬液500、1 000、1 500 mg/（kg·d），连续给药10 d。美沙拉嗪组第4天开始给予200 mg/（kg·d）美沙拉嗪治疗。对照组和模型组均给予等量蒸馏水。每天灌胃1次，连续给药10 d。

固肠胶囊动物给药剂量换算：根据人与实验动物间的药物剂量换算表进行计算。固肠胶囊临床成人推荐剂量为每次4粒（每粒0.375 g），每日3次，即每日总剂量为4粒/次×0.375 g/粒×3次=4.5 g。以成人平均体质量60 kg、体表面积1.62 m²及小鼠平均体质量22.5 g、体表面积0.007 m²计算，换算后小鼠等效剂量约为1 000 mg/（kg·d），故以此作为中剂量组；低剂量组[500 mg/（kg·d）]为等效剂量的1/2，高剂量组[1 500 mg/（kg·d）]为等效剂量的1.5倍。

结肠组织样本采集：实验结束后，处死大鼠，迅速取出结肠组织，取距肛门约1~5 cm处的结肠组织，一部分取约100 mg组织放入冻存管中，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱，用于提取RNA和蛋白质；另一部分用4%多聚甲醛固定，用于后续病理组织学分析。

1.3 观察指标 1.3.1 疾病活动指数（DAI）评分

观察小鼠精神状态、生存和大便状况，称取质量并用临床DAI评分。DAI评分基于体质量评分、粪便一致性和粪血（评为0~12分）。简而言之，DAI评分标准参考Wu等^[7]方法。体质量减轻（无变化0分，< 5%为1分，6%~10%为2分，11%~20%为3分，>20%为4分）。粪便性状（正常0分，软便且结构良好1分，无颗粒软便2分，腹泻4分），有无便血情况（无血0分，直肠可见血1分，直肠频繁出血2分，毛皮可见血迹4分）。按照公式计算DAI分值[DAI=（体质量下降得分+粪便性状得分+便血得分）÷3]，评估IBD模型建立及药物干预效果。

1.3.2 结肠组织病理学观察

实验结束后，处死大鼠，迅速取出结肠组织，取距肛门约1~5 cm处的结肠组织，10%福尔马林中浸泡24 h，用流水冲洗24 h，经乙醇、二甲基苯、石蜡包埋梯度系列脱水后，用自动旋转切片机切片，收集在玻片上。随后，切片用苏木精-伊红（HE）染色，并涂中性胶。最后在光学显微镜下观察肠道组织病理变化。切片进行HE染色，病理评分为0~6分（结合炎症细胞浸润评分和组织损伤评分）。评分标准参照Jiang等^[8]方法。评分标准为：炎性细胞浸润固有层（偶有炎性细胞0分，炎性细胞增加1分，炎性细胞汇流延伸至黏膜下层2分，经壁延伸3分）和组织损伤（无黏膜损伤0分，淋巴上皮病变1分，表面黏膜糜烂2分，广泛的黏膜损伤并扩展到肠壁的深层结构3分）。

1.3.3 ELISA法检测组织炎症因子表达

用CelLytic缓冲液和蛋白酶抑制剂混合物对结肠进行匀浆。蛋白浓度测定采用BCA测定法。细胞因子含量以总结肠蛋白含量（pg/mg）计算。按照ELISA法的试剂盒说明书操作，检测结肠组织中TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10和IL-1β的含量。

1.3.4 qRT-PCR法检测组织lncRNA THRIL表达水平

从结肠组织中提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，使用特异性引物进行qRT-PCR反应。以β-actin为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算lncRNA THRIL的相对表达量。引物序列如下。

lncRNA THRIL，F：5’-AACTCCTGACCTCAGGTGATCCAT-3’；R：5’-AAGGGAGTTTCAGAAGGTGTGGCT-3’。β-actin，F：5’-AAACAGGTGCACGTTTCAGG-3’；R：5’-CCAGGTCTCAGTTTGGAGAAGA-3’。

1.3.5 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测组织中p38MAPK/NF-κB通路蛋白表达水平

提取结肠组织总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。取适量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入p38MAPK、NF-κB p65、p-p38MAPK、p-p65一抗，4 ℃孵育过夜。次日加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育2 h，用ECL发光液显色，在凝胶成像系统下曝光显影，以β-actin为内参，分析各蛋白的相对表达量。

1.3.6 免疫组织化学法检测组织中p-p38MAPK、p-p65表达

切片常规脱蜡，在96 ℃的PT-Link中修复18 min，冷却至室温，用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次。切片以现用胰蛋白酶在37 ℃下消化10 min，然后滴加100 μL阻断液。载玻片于37 ℃湿箱中孵育10 min。滴加稀释后的p-p38MAPK和p-p65一抗，37 ℃湿箱孵育45 min。滴加100 μL二抗后，37 ℃湿箱孵育30 min。滴加100 μL新配制的DAB显色液5 min，水洗2 min，苏木精浸泡2 min重新染色，流动水冲洗回蓝，二甲苯浸泡，中性胶封膜，光镜下观察。

1.4 统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用独立样本t检验。P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 各组小鼠体质量及DAI评分比较

与对照组比较，模型组小鼠体质量降低（P < 0.05），DAI评分升高（P < 0.05）；与模型组比较，固肠胶囊中、高剂量组及美沙拉嗪组小鼠体质量升高（P < 0.05），DAI评分降低（P < 0.05），固肠胶囊低剂量组小鼠体质量变化差异无统计学意义（P>0.05），DAI评分降低（P < 0.05）。见图 1。

2.2 各组小鼠结肠组织病理学观察比较

对照组小鼠结肠结构完整，黏膜层细胞排列整齐，形态完整，黏膜层无炎性细胞浸润，隐窝排列整齐且未见缩短，无溃疡出现；模型组小鼠结肠组织结构破坏较严重，黏膜层细胞坏死并发现大量炎性细胞浸润，隐窝部分消失，腺体结构破坏严重，病理学评分较对照组升高（P < 0.05）；固肠胶囊低、中、高剂量组及美沙拉嗪组与模型组比较，主要表现为结肠结构、黏膜层结构基本完整，炎症细胞浸润减少，腺体结构部分恢复，隐窝完整性改善，病理学评分降低（P < 0.05）。见图 2。

2.3 各组小鼠组织炎症因子表达比较

与对照组比较，模型组小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6表达升高（P < 0.05），IL-4、IL-10表达降低（P < 0.05）；与模型组比较，固肠胶囊低、中、高剂量组及美沙拉嗪组小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6表达降低（P < 0.05），IL-4、IL-10表达升高（P < 0.05）。见图 3。

2.4 各组小鼠结肠组织lncRNA THRIL表达比较

与对照组比较，模型组小鼠lncRNA THRIL表达升高（P < 0.05）；与模型组比较，固肠胶囊低、中、高剂量组及美沙拉嗪组小鼠lncRNA THRIL表达降低（P < 0.05）。见图 4。

2.5 各组小鼠结肠组织p38MAPK/NF-κB通路蛋白表达比较

与对照组比较，模型组小鼠p-p38MAPK/p38MAPK、p-p65/p65表达升高（P < 0.05）；与模型组比较，固肠胶囊低、中、高剂量组及美沙拉嗪组小鼠p-p38MAPK/p38MAPK、p-p65/p65表达降低（P < 0.05）。见图 5。

2.6 各组小鼠结肠组织p-p38MAPK、p-p65蛋白表达比较

与对照组比较，模型组小鼠p-p38MAPK、p-p65蛋白表达升高（P < 0.05）；与模型组比较，固肠胶囊低、中、高剂量组及美沙拉嗪组小鼠p-p38MAPK、p-p65蛋白表达降低（P < 0.05）。见图 6。

3 讨论

IBD的发病机制涉及遗传易感性、肠道微生态失衡与免疫应答紊乱的交互作用，目前西医治疗以抑制异常免疫激活为主，但生物制剂耐药性及传统药物不良反应限制了其长期应用。中药复方因多环节调控炎症网络的特点，成为近年研究热点^[9]。本研究通过DSS诱导的小鼠IBD模型，证实固肠胶囊可以显著改善肠道炎症，其作用可能与调控lncRNA THRIL/p38MAPK/NF-κB通路相关。

中医理论认为IBD属于“泄泻”“肠澼”范畴，其病机演变具有“本虚标实、虚实夹杂”的特点，以脾胃虚弱为本，湿热、瘀滞、气滞为标，病程中常兼见寒热错杂^[10]。IBD反复发作的关键病机为脾胃气虚失运，肠腑固摄无权。脾主运化，胃主受纳，脾胃虚弱则水谷精微运化失常，湿浊内生，下注肠道而致泄泻；湿浊久蕴易化热，热伤肠络则见便血；气机阻滞则腹痛腹胀，形成“湿、热、瘀、滞”互结的标实证。固肠胶囊组方严格遵循“标本兼顾、涩补并施”的治则。以诃子、罂粟壳为君药，诃子酸涩微温，归肺、大肠经，能够涩肠止泻、敛肺下气；罂粟壳酸涩性平，归肺、大肠、肾经，可以固肠止泻、止痛，两者共奏“急则治标”之功。肉豆蔻、白术为臣药，肉豆蔻辛温，归脾、胃、大肠经，能够温中行气、涩肠止泻，既助脾胃运化以化湿，又补涩肠腑以止泻；白术甘温，归脾、胃经，益气健脾、燥湿利水，两药合用，“温脾以助运化，健脾以固根本”，实现“缓则治本”。木香、当归及甘草为佐使药，木香辛温，归脾、胃、大肠、三焦经，理气止痛、健脾消食，可防君药涩滞气机之弊；当归甘温，补血活血，针对肠络瘀滞之便血，“治风先治血，血行风自灭”，助气血运行以促进黏膜修复；甘草甘平，调和诸药，兼能益气和中。现代药理学研究显示，诃子含鞣质类成分可以保护肠黏膜屏障，罂粟壳中生物碱类成分具有中枢性镇痛及抑制肠道蠕动作用，白术多糖可以调节Th1/Th2免疫平衡。本研究中，固肠胶囊中、高剂量组显著降低DAI评分，减轻结肠病理损伤，可能与上述成分抑制炎症细胞浸润、促进黏膜修复有关，且其对IL-4/IL-10等抗炎因子存在上调作用，提示其具有调节免疫平衡的作用。

LncRNA THRIL作为近年发现的炎症相关非编码RNA，其在IBD中的作用机制逐渐被揭示。已有研究表明，THRIL可以通过结合hnRNPL蛋白增强TNF-α转录，或吸附miR-125b解除对NF-κB通路的抑制，从而放大炎症级联反应^[3]。研究阐明lncRNA THRIL在机体免疫反应中发挥的作用，其免疫调节功能已经在单核细胞和树突状细胞等多种免疫细胞中得到证实^[11]。Li等^[12]在敲低细胞的转录组分析中发现，THRIL缺失会导致其他免疫相关基因表达失调。此外，THRIL参与调节TNF-α的作用提示其可能对类风湿关节炎和IBD等常见炎症性疾病也存在影响^[13]。本研究结果显示，模型组THRIL表达显著升高，且与促炎因子水平呈正相关，而固肠胶囊干预后THRIL表达下调，提示其可能直接抑制THRIL转录，从而阻断炎症信号传导。

p38是MAPK的重要成员之一，可以调控炎症反应^[14]。p38MAPK信号通路可以被细胞因子、生理应激、活性氧、紫外线照射等细胞外信号激活^[15]。激活后，该通路通过调控下游转录因子参与组织细胞的炎症反应、分化、凋亡等病理生理过程。65 kDa NF-κB作为p38MAPK下游的重要分子之一，介导炎症因子产生及多种免疫细胞的增殖分化^[16]。研究表明，在肠缺血-再灌注肺损伤过程中，p38MAPK被激活，MAPK、NF-κB等炎症细胞因子表达增加^[17]。进一步研究显示，lncRNA THRIL通过抑制miRNA-24-3p表达加重脑缺血-再灌注损伤，导致NF-κB p65信号通路激活，并放大炎症反应^[18]。这表明THRIL通过促进NF-κB激活发挥加重炎症损伤的作用。本研究发现，模型组小鼠p-p38MAPK/p38MAPK、p-p65/p65比值显著升高，与THRIL表达呈正相关，而固肠胶囊可以剂量依赖性地抑制上述磷酸化蛋白水平，表明其对通路的双重抑制作用。这一结果与美沙拉嗪通过抑制NF-κB核转位发挥抗炎作用机制相似，但固肠胶囊对p38MAPK的调控可能为其独特优势^[19]。既往研究显示，中药活性成分如芍药苷、黄芩素可以通过靶向p38MAPK磷酸化位点抑制通路活性，推测固肠胶囊中多元成分可能通过类似机制发挥协同效应^[20]。

本研究虽然明确固肠胶囊可以通过下调lncRNA THRIL抑制p38MAPK/NF-κB通路改善IBD，但仍然存在明显局限性。其一，未设置单味药组分拆分组，固肠胶囊作为复方，无法明确诃子、白术等各药味在调控靶点及炎症通路中的具体贡献，亦不能锁定核心药效物质与成分间协同/拮抗作用。其二，给药周期仅10 d，聚焦短期炎症改善，缺乏长期给药实验数据，无法评估对IBD复发率、黏膜修复持续性的影响及长期用药安全性。其三，未检测肠道菌群多样性、代谢产物及肠黏膜紧密连接蛋白等指标，机制探讨不全面。其四，未探究固肠胶囊调控lncRNA THRIL的上游分子机制及THRIL与通路的直接作用靶点，通路调控链条不完善。

综上所述，本研究证实固肠胶囊通过下调lncRNA THRIL表达，抑制p38MAPK/NF-κB通路活化，减轻IBD小鼠肠道炎症反应，为其临床应用提供了“中药复方-非编码RNA-炎症通路”的作用机制新视角。