膝骨性关节炎（KOA）是一种以关节软骨退行性改变为核心，累及骨质、滑膜、关节囊及其他关节结构的慢性炎症性疾病^[1]。临床症状表现为逐渐加重的膝关节僵硬、肿胀、疼痛及功能障碍，且女性的患病率高于男性^[2]。衰老、肥胖是该病的主要致病因素^[3]，随着全球肥胖率和社会老龄化的不断增加，膝关节炎的患病率和致残率逐年上升，给家庭和社会带来沉重的经济负担^[4-5]。临床指南目前主要支持非药物治疗（如运动）和姑息性药物治疗（如非甾体抗炎药）预防病情进展和缓解疼痛症状。然而，对于KOA的有效治疗仍然存在不足，且现有的治疗手段无法有效恢复丧失的软骨^[6]。

电针作为一种传统的中医治疗方法，因其显著的镇痛效果和改善膝关节功能的作用，已经被广泛应用于KOA的治疗^[7]。然而，其具体作用机制仍未完全阐明。近期研究表明，电针的治疗效果可能与褪黑素（MLT）的产生密切相关^[8]。MLT是一种由体内松果腺产生的内源性活性吲哚类激素，参与疼痛调节^[9]，并对骨关节具有一定保护作用^[10]。研究表明MLT与MLT受体MT1及MT2结合能够激活相关的Gαs和Gαi信号通路，从而促进细胞内环磷酸腺苷（cAMP）的积累^[11]。cAMP通过与蛋白激酶A（PKA）结合并激活PKA以及激活交换蛋白（Epac）和离子门控通道来发挥第二信使的作用^[12]。cAMP反应元件结合蛋白（CREB）是PKA的重要靶蛋白之一，作为一种关键的转录因子，CREB在缓解疼痛和抑制炎性因子方面扮演重要角色^[13]。目前，关于电针如何调控MLT/cAMP/PKA/CREB信号通路治疗KOA的研究仍然较少。因此，本研究旨在探讨电针对兔KOA模型中相关MLT水平及MLT/cAMP/PKA/CREB信号通路的影响，以期为电针治疗KOA的临床应用提供更加深入的科学依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物与分组

本研究选用18只6月龄的健康雄性新西兰兔，体质量范围为（2.2±0.5）kg，由易生源基因科技（天津）有限公司提供，动物生产许可证号为SYXK（津）2021-0003。实验兔饲养于该公司动物中心实验室，环境条件为温度（24±0.5）℃，湿度40%~70%，并采用交替的光-暗周期，同时提供充足的食物和水。适应性喂养1周后，按照随机数字表法将兔分为假手术组、模型组和治疗组3组。预实验示电针组较模型组Mankin评分降低（2.1±1.3）分，依据G*Power估算，n=5，考虑15%损耗后每组6只。本实验严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》等相关规定，并获得伦理批准（伦理批号：YSY-DWLL-2023430）。

1.2 主要仪器和试剂

包埋机（湖北泰维），石蜡切片机（德国Leica），脱水机（德国Leica），组织摊片机（东莞科迪），一次性针灸针（0.30 mm×25 mm，中国江西华佗医疗器械有限公司），BT701-1B型电针治疗仪（青岛鑫升医疗），光学显微镜（日本奥林巴斯），异氟醚（山东科源），4%多聚甲醛、10%乙二胺四乙酸（南京全隆），苏木精-伊红（HE）染色试剂盒，番红O-固绿染色试剂盒（天津碧云天），蛋白酶抑制剂（美国ThermoFisher），PKA、CREB抗体（北京恒信），山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（武汉赛克），cAMP、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、MLT酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（北京万测），GAPDH抗体、β-tubulin抗体（武汉Proteintech），引物（北京生信诺），总RNA提取试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（上海优宁维），实时定量PCR仪（美国Agilent），转膜仪（北京六一生物科技），电泳仪（北京君意东方），Image J软件（美国NIH）。

1.3 造模方法

除假手术组，其他组均按照Hulth等^[14]方法建立KOA模型。在全身麻醉状态下，采用吸入剂异氟醚进行麻醉（诱导：4 L/min；维持：1.5 L/min）。仰卧位固定兔，在右后膝关节内侧行10 mm纵向切口，剥离并切断内侧副韧带以暴露关节腔，摘除内侧半月板后切开前后交叉韧带，并进行前抽屉实验以确认韧带断裂。在手术过程中避免损伤关节软骨，并在切除后逐层缝合。假手术组仅进行相同位置的皮肤切开术。围手术期给予兔抗生素预防，采用肌内注射青霉素（400 000 U/d）3 d。造模失败依照动物伦理要求及时补充并随机分配。

1.4 干预方法

治疗组接受了右膝关节的6个特定穴位治疗，包括犊鼻、内膝眼、足三里、血海和阳陵泉，穴位定位参考《实验针灸学》^[15]。具体操作步骤如下：将实验兔固定在操作台上，严格消毒，使用0.30 mm×25 mm的针灸针进行直刺，针刺深度为0.5~0.8 cm。针刺后接G6805型电针仪，疏密波，频率为6 Hz/15 Hz，强度2 mA，以实验兔右下肢体出现明显震颤感为度。留针20 min，期间不进行手法操作。本实验由经验丰富的操作者负责定时施术，每日1次，持续4周。假手术组及模型组未接受任何治疗。

1.5 观察指标及检测方法

行为学检测：根据实验设计，需要在手术后4周和治疗4周后分别对每只兔子进行1次Lequesne MG评分。按照Lequesne MG评分量表的评估标准^[16]，兔子的行为学表现被细分为疼痛、关节活动度、步态和关节肿胀4个关键维度进行评估。通过按压患膝观察疼痛程度（0分：无疼痛反应；1分：患肢出现轻微收缩；2分：患肢收缩伴轻度全身反应；3分：患肢剧烈收缩伴全身颤抖挣扎）；通过驱赶观察步态（0分：患肢无跛行；1分：患肢轻度跛行；2分：患肢跛行明显；3分：患肢不能蹬地）；通过关节屈曲范围观察活动度（0分：>90 °；1分：45 °~90 °；2分：15 °~45 °；3分：< 15 °）；通过膝上1指周径观察关节肿胀情况（0分：无肿胀；1分：轻度肿胀；2分：明显肿胀）。基于上述4个维度求和，总分越高膝关节功能障碍越严重。

取材方法：电针治疗4周后，所有实验兔通过3%戊巴比妥钠溶液（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，随后采用空气栓塞法处死。取右膝关节标本，放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色和番红O-固绿染色检测；刮取剩余股骨内外侧髁软骨和胫骨平台软骨样本，置于冻存管中并存放于-80 ℃冰箱，以备后续进行实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）检测。

HE染色及番红O-固绿染色观察膝关节软骨组织形态及病理评分：将组织在4%多聚甲醛中固定24 h，随后使用10%乙二胺四乙酸脱钙。样本经过脱水、浸蜡和包埋处理，最终切片至3 μm厚度。切片后，采用HE染色和番红O-固绿染色，随后进行脱水透明和封片。最后，使用光学显微镜在200倍放大倍数观察膝软骨切片的染色情况。参考Mankin’s评分表进行评分^[17]，评分标准如下：0分表示结构正常，潮线完整；1分表示细胞增多紊乱，表面不规则且有裂隙，多重潮线；2分表示细胞簇集，裂隙达中层，下血管入侵；3分表示细胞数量明显减少，裂隙达放射层；4分表示软骨层完全破坏。

ELISA法检测观察MLT、cAMP、MMP-13水平：抽取每组6只兔的腹主动脉血样，室温下静置20 min，将血液样本以3 000 r/min离心10 min（离心半径10 cm），取上层血清以备测定。采用ELISA测定试剂盒检测兔血清中MLT水平、软骨中cAMP水平，以及膝关节液中MMP-13含量。通过酶标仪在450 nm波长处测量吸光度，进行定量分析。

RT-PCR法检测松果体AANAT及膝关节软骨MTI、MT2 mRNA表达水平：将冻存的兔软骨组织20 mg研磨后，使用Trizol法提取总RNA。根据反转录试剂盒的操作说明，将提取的RNA逆转录为cDNA。稀释cDNA后，配置PCR扩增反应体系，预变性在95 ℃下进行5 min，随后进行40个循环，每个循环包括95 ℃持续10 s和60 ℃持续30 s。扩增结束后，将温度从60 ℃升高至95 ℃以建立熔解曲线。根据测得的Ct值，以GAPDH作为内参，通过2^-ΔΔCt法计算MT1、MT2和AANAT的相对表达量，具体引物序列见表 1。

Western blot法检测软骨细胞中PKA和CREB的蛋白相对表达量：取20 mg软骨细胞组织，在液氮中进行研磨后放置于冰上，然后加入150 μL RIPA裂解液和2 μL蛋白酶抑制剂混合物，充分裂解20 min。在4 ℃以12 000 r/min离心10 min（离心半径10 cm），收集上清液。接着使用BCA法对蛋白质进行定量检测，取30 μg蛋白质样品，放入100 ℃的金属水浴中加热10 min后进行上样。随后，通过10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电泳完成后将蛋白质转移至0.45 μm的PVDF膜。用5%的脱脂奶粉对膜进行封闭，接着加入1∶1 000稀释的一抗，在4 ℃孵育过夜。膜经过TBST洗涤（每次5 min，共3次）后，加入1∶10 000稀释的二抗，在室温下孵育60 min。最后，再次用TBST清洗3次，使用凝胶成像仪进行显影，并通过ImageQuant LAS4000mini图像系统分析蛋白条带图像。利用Image J软件计算相对灰度值，以β-tubulin作为内参计算目标蛋白的相对表达量。

1.6 统计学分析

统计分析采用IBM SPSS 26.0软件。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，每项实验均严格独立重复3次。首先对所有数据集进行正态性和方差齐性检验。当数据满足正态分布和方差齐性时，采用单因素方差分析及最小显著差异（LSD）检验来比较不同组之间的差异；如果数据未通过正态性或方差齐性检验，则使用Tamhane’s T2法进行分析。差异在P < 0.05时被认为具有统计学意义。

2 结果 2.1 Lequesne MG评分

在造模第28天后，模型组与假手术组的Lequesne MG评分比较，差异有统计学意义（P < 0.05），表明模型建立成功。治疗28 d后，模型组Lequesne MG评分高于假手术组（P < 0.001），治疗组评分低于模型组（P < 0.001）。见图 1。

2.2 兔右膝关节软骨病理特征及Mankin’s评分

HE及番红O-固绿染色结果显示，假手术组的软骨表面无明显缺损，软骨细胞排列整齐、无紊乱，软骨结构清晰，细胞形态正常。模型组软骨细胞则表现出聚集、龟裂、排列不规则，细胞形态不完整，潮线模糊，且软骨下骨呈现部分裸露现象。与模型组相比，治疗组的软骨表面更加光滑，细胞排列整齐，呈现柱状阵列。尽管部分区域可见软骨细胞缺损及重复潮线，但整体细胞形态基本正常，并且未观察到软骨下骨裸露。此外，与假手术组相比，模型组Mankin’s评分升高（P < 0.001），治疗组Mankin’s评分低于模型组（P < 0.001）。图 2。

2.3 兔松果体中AANAT、血清MLT及膝关节软骨组织中MT1、MT2 mRNA表达

与假手术组相比，模型组松果体中AANAT、软骨中MT1、MT2的mRNA表达水平升高（P=0.073、P=0.009、P=0.011），血清MLT表达下降（P=0.002）。与模型组相比，治疗组松果体中AANAT、血清MLT、软骨中MT1、MT2的mRNA表达水平升高（P=0.024、P=0.014、P=0.004、P < 0.001）。见图 3。

2.4 兔右膝关节软骨组织中cAMP、PKA、CREB蛋白表达及膝关节液MMP-13水平

与假手术组相比，模型组软骨细胞中cAMP、PKA和CREB蛋白表达水平降低（P < 0.001、P < 0.001、P=0.004），膝关节液MMP-13水平升高（P < 0.001）。与模型组相比，治疗组软骨细胞中cAMP、PKA和CREB蛋白表达水平升高（P < 0.001、P=0.045、P=0.024），膝关节液MMP-13水平下降（P < 0.001）。见图 4。

3 讨论

KOA在中医称为“膝痹”，其主要病因是肝肾不足以及外界风寒湿邪侵袭，呈现出本虚标实和本痿标痹的证候特征^[18]。疼痛是本病的主要临床表现，炎症和生物力学失稳是造成膝关节疼痛的主要因素^[19]。电针作为一种非药物治疗手段，因其疗效显著、无创性和不良反应小等优点被广泛认可和应用。本研究结果表明，低频电针治疗显著降低了兔KOA模型的Lequesne MG评分，说明电针在缓解KOA兔疼痛方面具有良好疗效。HE染色、番红O-固绿染色及Mankin’s评分显示，模型组兔膝关节软骨细胞的病理损害严重程度明显高于假手术组；而治疗组软骨细胞病理损伤程度较模型组减轻，说明电针能够有效抑制KOA兔的关节软骨损伤。

最新研究表明，炎症（尤其是滑膜炎症）是影响KOA发生和发展的关键因素。在这一过程中，MMP-13作为一种重要的诱导炎性因子产生的基质金属蛋白酶，其过度表达不仅可能通过激活其他类型的基质金属蛋白酶来抑制破骨细胞形成，还会促进关节软骨中主要结构蛋白[如蛋白聚糖和Ⅱ型胶原（Col 2a1）]的降解，导致软骨下骨中的骨桥蛋白裂解，诱发微骨折痛^[20]，加重KOA进展，导致更严重的软骨降解和疼痛。因此，减少炎症因子的表达被认为是延缓KOA进展的有效策略。

MLT作为一种疼痛介质，与痛觉敏化关系密切，且具有显著的镇痛作用。研究表明，电针可以持续刺激交感神经兴奋，激活“坐骨神经-脊髓-交感链”这一完整的神经反射弧^[21]。与此同时，电针通过局部阿片肽（β-内啡肽、脑啡肽）释放，抑制NADPH氧化酶亚基p47phox膜转位，减少超氧阴离子生成，降低ROS对AANAT蛋白的氧化损伤^[22]，延长MLT半衰期，这解释了本研究治疗组血清MLT显著上升的原因。

当MLT浓度升高后，其与膝关节软骨细胞膜上高亲和力的MT1/MT2受体结合，不仅可以抑制兴奋性神经递质谷氨酸的释放，促进间充质干细胞向软骨缺损部位迁移和分化，显著降低MMP-13的表达水平^[23]，还可以触发Gαs-AC-cAMP信号轴，同时抑制Gαi对AC的负向调控，使得细胞内cAMP水平快速累积^[24]。cAMP结合于PKA调节亚基上的4个位点，进而激活PKA，激活的PKA调节亚基RⅡ别构释放催化亚基Cα，Cα进入细胞核磷酸化CREB Ser133^[25]。CREB作为一种调节蛋白，与CREB结合蛋白（CBP）结合后，使得染色质从封闭状态转变为开放状态^[26]，这一过程通常会促进RNA聚合酶Ⅱ及基础转录因子与开放的DNA结合，启动转录，常涉及抗炎细胞因子的表达，如白细胞介素-10（IL-10）^[27]。IL-10通过自分泌或旁分泌方式，抑制p38 MAPK和JNK的磷酸化，阻断MyD88-IRAK4-TRAF6信号级联，减少NF-κB p65核转位，进而下调MMP-13等促炎介质的表达^[28]。

本研究采用Hulth法成功建立了兔KOA模型。造模后模型组兔较假手术组血清MLT、软骨cAMP、PKA和CREB含量明显降低，膝关节液MMP-13含量、松果体中AANAT、软骨中MT1、MT2的mRNA表达水平明显升高。HE及番红O-固绿染色示软骨磨损严重，出现软骨下骨裸漏的现象。这表明经手术造模的KOA兔血清MLT、软骨cAMP、PKA和CREB表达被抑制，膝关节液MMP-13表达升高，导致膝关节微环境炎症化，加剧了疼痛与软骨退变。本研究结果显示，使用电针治疗后，治疗组兔右膝关节疼痛、步态、肿胀及关节活动度较模型组均明显改善，表明电针可以有效改善KOA兔膝关节疼痛和功能障碍。且治疗组血清MLT、软骨cAMP含量、松果体中AANAT、软骨中MT1、MT2的mRNA及PKA和CREB蛋白表达升高，膝关节液MMP-13含量降低，炎症微环境及软骨损伤得到改善，表明电针可以通过上调MLT、cAMP、AANAT、PKA和CREB表达，下调MMP-13表达，改善软骨退变。

综上所述，本研究表明电针对KOA兔症状改善明显，其机制可能与电针促进MLT合成，并且进一步激活cAMP/PKA/CREB信号通路，使CREB磷酸化，进而减轻其引起的炎性反应，降低MMP-13的表达，起到镇痛和保护软骨损伤的作用。然而，电针在KOA中对MLT/cAMP/PKA/CREB信号通路的双向调节作用及其与其他通路的相互作用，尚需要通过特异性阻断或激活关键节点的研究进一步阐明。