豨莶草为菊科植物豨莶Siegesbeckia orientalis L.、腺梗豨莶Siegesbeckia pubescens Makino或毛梗豨莶Sigesbeckia glabrescens Makino的干燥地上部分，性辛，味苦、寒，归肝、肾经，具有祛风湿，利关节，解毒的功效 ^[1]。现代研究表明，豨莶草具有抗炎 ^[2]、抗血栓 ^[3]、降血糖 ^[4]、抗肿瘤 ^[5]等多种药理作用。豨莶草主要分布于湖北、四川、浙江、河北等多个省份 ^[6]，其主要含有二萜类、倍半萜类、黄酮类等化学成分 ^[7]。《中国药典》2025年版一部中将奇壬醇作为豨莶草含量测定的唯一指标 ^[1]。中药成分复杂，仅单一成分的含量测定，无法全面对其质量进行评价，中药指纹图谱可以从整体上对中药的成分进行分析，能较全面完整地反映中药材的质量特征 ^[8-9]。

目前大多采用紫外检测器（UV）或蒸发光散射检测器（ELSD）进行豨莶草药材指纹图谱及含量测定的研究，测定豨莶草药材中奇壬醇、豨莶苷、Hythiemoside B或豨莶精醇的含量 ^[10-13]。然而，大多数二萜类化合物缺少紫外发色团，无法用常规HPLC-UV联用技术实现该类成分的定量检测。此外，ELSD为通用型检测器，但其灵敏度低、重现性较差 ^[14]。电喷雾检测器（CAD）灵敏度高、重现性好、线性范围宽，作为一种新型通用型检测器，尤其适用于无紫外吸收或弱紫外吸收的物质检测 ^[15-17]。同时，CAD是一个质量敏感型检测器，响应值与进样成分的含量相关，特别适合中药材指纹图谱的全面成分分析，可定量化表征其中的化学成分，广泛应用于天然产物、药物的分析检测 ^[18-19]。

因此，研究建立了一种HPLC-CAD检测分析方法，用于豨莶草指纹图谱的建立及多成分的定量分析，为豨莶草质量控制研究提供新方法。

1 仪器与材料 1.1 仪器

高效液相色谱仪（UltiMate 3000型配备Corona Veo电雾式检测器，美国赛默飞世尔科技公司）；超纯水制备仪（Milli-Q，美国密理博公司）；十万分之一天平（MSA225P-0CE-DU，德国赛多利斯公司）；超声波清洗机（XM-P22H，中国小美超声仪器有限公司）。

1.2 材料

甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，购自于天津市康科德科技有限公司。对照品绿原酸（批号DST221010-021，纯度≥98%）、芦丁（批号DSTDL001 702，纯度≥98%）、3，4-二咖啡酰奎宁酸（批号MUST-13081402，纯度≥98%）、4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸（批号DSTDY003804，纯度≥98%）、奇壬醇（批号DSTDQ006201，纯度≥98%）、豨莶苷（批号DSTDX012001，纯度≥98%）、Hythiemoside B（批号DSTDH035501，纯度≥95%）、豨莶精醇（批号DST241024-098，纯度≥98%），均购自成都德斯特生物技术有限公司。豨莶草药材购自国内多个省份，经天津中医药大学常艳旭教授鉴定为菊科植物腺梗豨莶Siegesbeckia pubescens Makino的干燥地上部分，保存于天津中医药大学中医药研究院，具体来源信息见表 1。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

采用Eclipse Plus C₁₈色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流动相：0.1%（v/v）甲酸水溶液（A）和乙腈（B），流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；CAD雾化器温度：35 ℃；数据采集频率：10 Hz；过滤常数：5.0 s。梯度洗脱程序见表 2。

2.2 供试品溶液的制备

精密称定豨莶草药材粉末300 mg（过三号筛），精密量取7.5 mL的75%甲醇溶液，称定质量，超声处理45 min（功率300 W，频率40 kHz），静置至室温，补足至初始质量，经微孔滤膜（0.22 μm）过滤，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称定对照品绿原酸、芦丁、3，4-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸、奇壬醇、豨莶苷、豨莶精醇适量，加75%甲醇溶液配制成1.0 mg/mL的对照品溶液。精密称定对照品Hythiemoside B适量，加75%甲醇溶液配制成3.0 mg/mL的对照品溶液。取各对照品储备液适量，用75%甲醇溶液配制成含芦丁、3，4-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸、奇壬醇、豨莶苷、豨莶精醇（120 μg/mL），绿原酸和Hythiemoside B（180 μg/mL）的混合对照品溶液。

2.4 豨莶草HPLC指纹图谱的建立 2.4.1 精密度实验

取同一豨莶草供试品溶液（S1），按“2.1”项下色谱条件进样测定，连续进样6次，以奇壬醇为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的相对标准偏差（RSD）均≤0.12%，相对峰面积的RSD均≤1.55%，表明该方法精密度良好。

2.4.2 重复性实验

取同一豨莶草药材粉末（S1）适量，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以奇壬醇为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD均≤0.17%，相对峰面积的RSD均≤4.33%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性实验

取同一豨莶草供试品溶液（S1），按“2.1”项下色谱条件进样测定，在0、4、8、12、16、24 h时间点下分别进样，以奇壬醇为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD均≤0.13%，相对峰面积的RSD均≤3.90%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4 豨莶草HPLC指纹图谱的建立与相似度评价

取21批豨莶草供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，得到不同产地豨莶草HPLC色谱图，将数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）进行分析，选定S1为参照图谱，时间窗宽度设定为0.1 min，经过多点校正和Mark峰匹配，生成豨莶草药材指纹图谱及对照图谱R，标定结果显示共有峰17个，见图 1。经过与对照品比对，指认出8个特征峰：2号峰绿原酸、3号峰芦丁、4号峰3，4-二咖啡酰奎宁酸、5号峰4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸、7号峰奇壬醇、8号峰豨莶苷、11号峰Hythiemoside B、13号峰豨莶精醇。21批豨莶草药材相似度较高，均在0.912以上，质量相对稳定，结果见表 3。

2.5 含量测定 2.5.1 专属性考察

取豨莶草药材粉末（S1）适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，取“2.3”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录HPLC色谱图，如图 2所示。结果表明，在绿原酸、芦丁、3，4-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸、奇壬醇、豨莶苷、Hythiemoside B、豨莶精醇相应保留时间内，各化合物分离度良好，无杂质干扰，表明该方法专属性良好。

2.5.2 线性关系考察

精密量取“2.3”项下混合对照品储备液，用75%甲醇溶液依次稀释制备成不同浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，将不同浓度的混合对照品溶液进行测定。以各对照品的峰面积为纵坐标（Y），各对照品的质量浓度为横坐标（X），进行线性回归计算，得到回归方程。根据信噪比S/N为3∶1和10∶1时相应浓度确定检测限（LOD）和定量限（LOQ）。8个化合物在相应的线性范围内均r≥0.999 3，表明线性关系良好，结果见表 4。

2.5.3 精密度实验

取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算得上述8个成分峰面积的RSD分别为1.82%、2.99%、1.39%、1.17%、0.10%、0.76%、2.76%、1.53%，表明该方法日内精密度良好。同法连续测定3 d，计算得上述8个成分峰面积的RSD分别为0.48%、2.02%、1.76%、3.34%、0.55%、0.52%、2.20%、2.32%，表明该方法日间精密度良好。

2.5.4 稳定性实验

取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件在0、4、8、12、16、24 h时间点下分别进样，计算得上述8个成分峰面积的RSD为0.65%-2.67%，表明样品在24 h内稳定性良好。

2.5.5 重复性实验

取同一豨莶草药材粉末（S1）适量，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样，计算得上述8个成分峰面积的RSD分别为1.82%、1.67%、2.46%、2.94%、1.49%、1.02%、1.84%、1.13%，结果表明该方法重复性良好。

2.5.6 加样回收率实验

精密称定豨莶草药材粉末（S1），并分别精密加入与药材中含量1∶1比例的对照品，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，进样测定，计算得上述8个成分的平均加样回收率分别为101.20%、101.04%、100.87%、102.99%、102.07%、101.52%、102.03%、102.58%，RSD均≤ 1.71%，表明该方法的准确度符合要求。

2.5.7 含量测定

取21批豨莶草药材粉末，每批按“2.2”项下方法平行制备3份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算含量，21批豨莶草药材中绿原酸、芦丁、3，4-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸、奇壬醇、豨莶苷、Hythiemoside B、豨莶精醇的含量范围分别为0.13~ 0.66、0.03~0.25、0.04~0.46、0.03~0.09、1.04~4.35、0.04~1.76、0.05~0.21、0.04~0.79 mg/g，结果见表 5。

3 讨论 3.1 检测器的选择

奇壬醇、豨莶苷、Hythiemoside B和豨莶精醇均为二萜类化合物，在紫外区只有末端吸收，通过比较豨莶草的CAD与DAD检测色谱图，发现CAD获得的色谱峰比DAD的多，且特征峰的峰形好、响应值高，基线更平稳，指纹图谱特征性更强，因此本研究选用CAD检测器建立豨莶草指纹图谱并进行含量测定研究。通过系统的方法学考察，结果显示采用HPLC-CAD方法建立的豨莶草指纹图谱，精密性、重复性和稳定性良好，表明该方法准确、稳定。

近年来，CAD检测器因其自身特点，在中药萜类、皂苷类及生物碱类等化合物检测方面具有明显的优势而被广泛使用。龙书可等 ^[20]采用HPLC-CAD法测定银杏叶片中萜类内酯（白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C）的含量，结果显示该法检测灵敏度、重现性均优于法定标准的HPLC-ELSD法。廖渝等 ^[21]建立了HPLC-CAD法对不同产地柴胡药材中皂苷（柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷d）的含量进行测定，结果显示CAD基线平稳、分离度好、峰形对称、准确度高，检测效果显著优于HPLC-UV法。Long等 ^[22]建立了HPLC-CAD法对非衍生化的浙贝母中5种异甾体生物碱（西贝碱、贝母辛、贝母甲素、贝母素乙、梭砂贝母碱）的含量进行测定，并与ELSD法对比显示CAD灵敏度比ELSD高出30~55倍。HPLC-CAD法还可用于检测黄酮、有机酸、氨基酸、糖、脂类、表面活性剂等成分，2025年版《中国药典》已收载CAD检测器，适用于非挥发或半挥发性物质，尤其适用于无紫外吸收或弱紫外吸收物质的高灵敏度检测和全面分析 ^[17]。

3.2 提取条件优化

研究结合文献综合考虑豨莶草中活性成分包括二萜类、酚酸类及黄酮类化合物，因此选择甲醇作为提取溶剂 ^[23-24]，进而考察了甲醇溶剂体积分数（25%甲醇溶液、50%甲醇溶液、75%甲醇溶液、100%甲醇溶液）、提取时间（15、30、45、60 min）、料液比（mg/mL）（60∶1，50∶1，40∶1，30∶1）对豨莶草药材中活性成分总含量的影响。结果显示提取条件为使用7.5 mL75%甲醇溶液加入300 mg豨莶草药材粉末，超声提取45 min时，豨莶草药材中活性成分总含量最高，因此确定其为最佳提取条件。

3.3 指纹图谱及含量测定结果分析

研究建立了豨莶草药材HPLC-CAD指纹图谱，21批豨莶草药材共确定了17个共有峰，指认了其中8个成分，21批药材指纹图谱与对照指纹图谱的相似度为0.912~0.978。指纹图谱的整体峰形及特征共有峰的相对保留时间一致，说明21批豨莶草药材一致性良好，化学成分组成整体上相关性良好，但各共有峰的相对峰面积有一定的差异，说明不同批次药材质量存在差异 ^[25-26]。因此，研究采用HPLC-CAD法对21批豨莶草药材的8个成分进行含量测定分析，结果表明，豨莶草中奇壬醇（1.04~4.35 mg/g）的含量最高，豨莶苷（0.04~1.76 mg/g）、绿原酸（0.13~ 0.66 mg/g）、豨莶精醇（0.04~0.79 mg/g）和3，4-二咖啡酰奎宁酸（0.04~0.46 mg/g）的含量次之，芦丁（0.03~0.25 mg/g）、Hythiemoside B（0.05~0.21 mg/g）和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸（0.03~0.09 mg/g）的含量最低。21批豨莶草药材不同产地间奇壬醇、豨莶苷、绿原酸的含量相差较大，四川、湖南、江苏药材中奇壬醇的含量较高，湖北、河南、江苏药材中豨莶苷的含量较高，湖北、湖南药材中绿原酸的含量较高。相同产地的不同批次药材的个别成分含量也有差异，如河南（S10、S11）药材中豨莶精醇的含量差异较大，湖北（S1~S6）药材中与其他批次相比S4、S6的奇壬醇的含量较高而绿原酸含量较低。产生该现象可能是由于豨莶草药材产地、气候、采收时期等因素影响，导致成分含量波动 ^[27]。

4 总结

研究建立了豨莶草药材HPLC-CAD指纹图谱及多成分含量测定分析方法，方法学结果表明，该方法精密度、重复性、稳定性均良好，结果稳定可靠。在此基础上，对21批药材进行了指纹图谱分析，标定共有峰17个，指认8个，其中弱紫外吸收的二萜类成分（奇壬醇、豨莶苷、Hythiemoside B、豨莶精醇）在CAD检测器下获得了良好的分离与检测，所得指纹图谱能够较全面地反映药材化学成分信息。对21批豨莶草药材进行了指纹图谱相似度评价，结果表明21批豨莶草药材质量一致性较高（相似度0.912 ~ 0.978），说明市售豨莶草药材在化学成分的整体比例上一致性良好。研究采用的批次偏少且各产地所含批次数目不同，尚不足以全面体现药材因产地生态差异导致的质量波动，后续应扩大采样范围，补充不同生长周期及采收时节的样品，进一步完善豨莶草质量评价体系。

此外，研究根据指纹图谱指认的共有峰对豨莶草的8个活性成分进行含量测定，包括绿原酸、芦丁、3，4-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸、奇壬醇、豨莶苷、Hythiemoside B、豨莶精醇。含量测定结果表明不同批次之间同一成分含量存在一些波动，可能是原药材来源和采收工艺等导致的。综合含量测定结果，除2025版《中国药典》的质控成分奇壬醇外，豨莶苷的含量相对较高，且现有药理研究表明，其具有抗痛风性关节炎的作用，与豨莶草祛风湿、利关节的功效一致。因此，在后续豨莶草药材质量评价研究中，豨莶苷可作为质控标志性成分进行深入分析。综上，研究所建立的HPLC-CAD指纹图谱结合多成分含量测定分析方法，重复性好、灵敏度高，可为豨莶草药材质量控制体系的完善提供技术参考。