近年来，随着对补骨脂的研究不断深入以及应用范围的扩大，有关补骨脂导致肝损伤的报道日益增多，严重影响了其临床应用的安全性 ^[1-2]。新补骨脂异黄酮（NBIF）是从补骨脂中提取分离获得的黄酮类化合物，具有抗菌 ^[3]、抗炎 ^[4]、抗癌 ^[5]、抗骨质疏松 ^[6]等药理活性。NBIF是补骨脂肝毒性的主要成分之一 ^[7]，其在人体和动物体内的毒性鲜有报道，但是已有研究证实NBIF在HepG2细胞、LO2细胞上显示出强烈的细胞活力抑制作用，具有较强的肝细胞毒性作用 ^[8]，但对其机制的研究尚不深入。

HepaRG细胞作为目前公认的“最接近人原代肝细胞”的永生化肝细胞系，在体外肝研究领域应用广泛。而3D培养技术通过重构细胞间三维空间结构与微环境，进一步放大了HepaRG细胞的生理模拟能力，使其在药物肝毒性研究中展现出远超传统2D培养的优势 ^[9-10]，核心在于更精准复现人肝细胞的结构特征、功能状态及毒性响应规律，为体外肝毒性评价提供更可靠的“人体替代模型”。本研究旨在利用3D培养的HepaRG细胞球模型结合代谢组学技术，探究新补骨脂异黄酮导致肝毒性的相关代谢途径，为深入理解其肝毒性机制提供关键的实验数据，为进一步研究提供参考。

1 材料 1.1 受试药

NBIF，购于成都格利普生物科技有限公司。

1.2 细胞株

HepaRG细胞，购自上海冠导生物工程有限公司。

1.3 试剂

RPMI 1640培养基，美国Gibco公司；胎牛血清，北京全式金生物技术有限公司；细胞计数试剂盒-8（CCK-8），美国GLPbio公司；Annexin VFITC/PI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；乙腈（色谱级），购自美国Sigma公司。

1.4 仪器

Spark酶标仪（瑞士TECAN），Guava easyCyte流式细胞仪（美国Luminex公司），超高效液相色谱仪ExionLC（美国AB SCIEX公司），高分辨质谱仪Triple TOF 5600 system（美国AB SCIEX公司）。

2 方法 2.1 HepaRG细胞3D培养及给药

HepaRG细胞采用含有10%胎牛血清的1640完全培养基，置37 ℃、5%二氧化碳（CO₂）培养箱中培养。当细胞生长达80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化，以4.5×10⁴细胞/mL的接种密度接种于低吸附U形底96孔板，200 μL/孔，构建HepaRG细胞3D培养模型。培养至第4天，分为4组，依据课题组前期的研究基础 ^[11]设置给药浓度，即0、2.5、5.0、10.0 μmol/L组，分别为NBIF 0、2.5、5.0、10.0 μmol/L给药，每天1次，连续5次。

2.2 CCK-8法测定细胞活力

单次和第5次给药24 h后，每孔加入10%的CCK-8，于恒温培养箱中孵育4 h后，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，计算细胞活力。细胞活力（%）=（OD测量值-外径空白值）（/OD对照值-外径空白值）×100%。

2.3 流式细胞仪测定细胞凋亡

采用AnnexinV/PI双染色法。5次给药24 h后，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，消化、收集细胞，随后加入100 μL结合缓冲液重悬细胞。加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI室温避光孵育15 min。随后加入400 μL结合缓冲液混合均匀，过滤后，流式细胞仪检测。

2.4 代谢组学分析 2.4.1 细胞上清液制备

使用无菌移液器轻柔吸取培养孔内“HepaRG细胞-培养基”混合液，转移至预冷的1.5 mL低吸附离心管中，4 ℃条件下300×g离心5 min，吸取上清液，过滤，冻存，待代谢组学检测。

2.4.2 细胞上清前处理

上清样本于室温解冻后，1.5 mL离心管中加入300 μL上清和1 mL乙腈，涡旋3 min，于4 ℃低温离心10 min，8 000 r/min，离心半径8.2 cm，吸取1 mL上层清液至真空浓缩离心机下浓缩挥干，加100 μL 50%乙腈复溶，涡旋混匀3 min，4 ℃下14 000 r/min离心10 min，吸取80 μL上层清液，4 ℃下14 000 r/min二次离心10 min，吸取60 μL上清液用于质谱检测。

2.4.3 色谱条件

Shim-pack GISSC₁₈色谱柱（2.1mm×100 mm，1.9 μm），柱温为40 ℃，进样量为5 μL，流速为0.2 mL/min。流动相为0.1%甲酸水（A）和0.1%甲酸乙腈（B）。梯度洗脱条件为0~1 min，5%B；1~15min，5%~95% B；15~17 min，95% B；1717.1 min，95%~5% B；17.1~20 min，5% B；整个进样过程样品置于4 ℃自动进样器中。

2.4.4 质谱条件

采用电喷雾电离源（ESI源），在正、负离子电离模式下进行质谱检测分析。设置分子量扫描范围为100~1 500 m/z；喷雾电压为5 500 V；离子源温度550 ℃；气帘气35 Psi；去簇电压为80 V/-80 V；碰撞能量10/-10 eV。本实验运用Triple TOFTM5600系统（AB SCIEX ExionLCTM AC，美国）进行代谢组学分析。

2.4.5 代谢组学数据处理与多元统计分析

原始质谱数据由Analyst Software 1.6.1收集处理。数据归一化后，导出到SIMCA-P V14.1进行多元统计分析，Metabo Analyst进行通路分析。

2.4.6 差异代谢物及代谢通路分析

根据变量重要性投影（VIP） > 1和t检验（< 0.05）作为组间差异代谢物筛选的受限条件寻找差异代谢物。运用MetaboAnalyst（http://metpa.metabolomics.ca）网站对筛选出的差异代谢物进行通路富集分析，筛选相关代谢通路。

2.5 统计学分析

采用SPSS 20.0统计学软件，数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析比较各组间差异。

3 结果 3.1 HepaRG细胞3D培养模型的建立

HepaRG细胞在重力的作用下，逐渐聚集，建立细胞与细胞之间的联系，形成稳定类器官球体，3D培养模型建立成功，可进行后续的药物毒性实验。见图 1。

3.2 NBIF对3D培养HepaRG细胞活力的影响

如图 2所示，单次给药后，与NBIF 0 μmol/L组比较，NBIF 2.5、5.0、10.0 μmol/L组HepaRG细胞活力未见明显变化（见图 2A）。5次给药后，与对照组比较，NBIF 2.5、5.0、10.0 μmol/L组HepaRG细胞活力可见剂量依赖性降低，其中NBIF10组降低显著（P < 0.01）（见图 2B）。比较单次给药和重复5次给药后细胞活力结果（见图 2C），可见随着给药浓度的升高和给药次数的增加，NBIF对3D培养HepaRG细胞活力的影响具有剂量依赖性降低作用和积累效应。

3.3 NBIF对3D培养HepaRG细胞凋亡的影响

5次给药后，HepaRG细胞早期凋亡率在NBIF 0 μmol/L组为6.86%，NBIF 2.5、5.0、10.0 μmol/L组分别为3.84%、11.56%、28.44%，与对照组比较，NBIF 5.0、10.0 μmol/L组HepaRG细胞的早期凋亡率明显升高。见图 3。

3.4 NBIF对3D培养HepaRG细胞代谢组学的影响 3.4.1 细胞上清样本代谢产物鉴定分析

对细胞上清样品的质谱原始数据进行预处理后，上传MetDNA线上代谢组学数据分析平台得到代谢物鉴定的结果。结果显示，在5次给药后，正离子模式下，检测出50个有代谢物的峰，共鉴定出16个代谢产物；在负离子模式下，检测出275个有代谢物的峰，共鉴定出53个代谢产物。

3.4.2 多元统计分析

PCA结果表明，在正、负离子模式下，NBIF 0、2.5、5.0、10.0 μmol/L 4组代谢物基本分别聚集，得到较好的分离，说明NBIF使3D培养HepaRG细胞代谢产生了变化，见图 4。采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）寻找组间差别，如图 5所示，在正、负离子模式下，NBIF 2.5、5.0、10.0 μmol/L组与NBIF 0 μmol/L组之间均呈现出组内聚集与组间分散的趋势，提示2.5、5.0、10.0 μmol/L给药浓度下的NBIF对细胞代谢物均产生了明显的影响。通过200次置换检验对模型进行验证，如图 6所示，正负离子模式下，R2和Q2分别低于最右的原值，且Q2与Y轴相交于负半轴，表明该模型没有过拟合且预测能力良好。观察VIP-plot图可知，顶端的离子VIP值相对较高，对代谢轮廓的变化贡献较大，底部的离子VIP值相对较低，对代谢轮廓的变化贡献较小。

3.4.3 差异代谢物筛选

在建立OPLS-DA模型基础上，选择VIP > 1，P < 0.05作为筛选潜在差异代谢物的条件。5次给药，共筛出17个差异代谢物，含量均下调，如表 1所示。

3.4.4 代谢通路分析

将上述筛选出的代谢差异物导入Metaboanalyst5.0数据库进行代谢通路分析，以-log（p） > 1，Pathway impact > 0为筛选标准，筛选出潜在的代谢通路，NBIF 0 μmol/L与NBIF 2.5、5.0、10.0 μmol/L组间比较分别得到5、6和6条通路，包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、脂肪酸生物合成、维生素B6代谢、精氨酸生物合成等通路（见图 7）。图中纵坐标-log（p）代表通路的显著性水平，值越大节点则颜色越深；横坐标为通路影响值（Pathway impact），代表代谢通路影响的重要程度。结果表明，给药组细胞上清代谢物与酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢相关性最强，其次为不饱和脂肪酸及脂肪酸的生物合成。

4 讨论

NBIF是从补骨脂中分离而得，与直接靶标mTOR结合良好，是其肝毒性分子起始事件之一 ^[12]。本研究中，新补骨脂异黄酮可致3D培养HepaRG细胞活力降低，这确认新补骨脂异黄酮对3D培养HepaRG细胞有毒性。

代谢组学通过分析生物体的代谢产物反映机体整体的代谢情况，与中医的整体观一致，在确定毒性生物标志物和潜在的毒性作用机制方面具有显著的优势，已被初步应用于肝毒性、肾毒性、心脏毒性等多种毒性的评估 ^[13-14]。

代谢组研究结果显示，与对照组比较，新补骨脂异黄酮处理组的代谢物中共筛出17个差异代谢物，含量均下调，代谢物与酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢相关性最强，其次为不饱和脂肪酸及脂肪酸的生物合成。而苯丙氨酸和色氨酸人体细胞无法合成，细胞上清代谢物中苯丙氨酸和色氨酸含量降低，可能是HepaRG细胞对细胞上清中苯丙氨酸和色氨酸的摄取、利用增加所致。

苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸是芳香族必需氨基酸，对于肝细胞有着相当重要的影响。苯丙氨酸参与了组织蛋白质的构成，其主要的代谢途经被认为是在肝脏等组织中，通过苯丙氨酸羟化酶的作用转化生成酪氨酸，进而参与合成某些激素和神经递质等。苯丙氨酸和酪氨酸均参与了合成激素、神经递质、糖代谢与脂代谢。而色氨酸则在蛋白质生物合成中起到重要作用，已经被证明参与了氧化应激和炎症反应。由于大部分色氨酸在肝脏中代谢，药物导致肝损伤时通常会伴有色氨酸的代谢紊乱。

此外，NBIF给药后细胞上清的差异代谢物中，不饱和脂肪酸肉豆蔻酸和棕榈酸、饱和脂肪酸硬脂酸均显著下调，说明NBIF导致了脂肪酸的生物合成等脂质代谢紊乱。

综上所述，NBIF对HepaRG细胞的3D细胞球有显著的细胞毒性，给药后引起了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成代谢紊乱以及脂质代谢紊乱，可能进一步引发氧化应激等相关的肝细胞凋亡（如结果所示），但引起肝细胞凋亡的确切机制，还有待进一步研究。