2026, Vol. 45文章信息
- 崇海云, 贾亚倩, 曹月娟
- CHONG Haiyun, JIA Yaqian, CAO Yuejuan
- 葛根素通过调控PPARγ/NF-κB通路减轻缺氧复氧诱导的心肌细胞损伤
- Puerarin mitigates hypoxia-reoxygenation-induced cardiomyocyte injury by modulating the PPARγ/NF-κB pathway
- 天津中医药大学学报, 2026, 45(6): 680-688
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2026, 45(6): 680-688
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2026.06.08
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文章历史
收稿日期: 2026-01-20
引用本文 |
2. 沧州市人民医院，沧州 061001;
3. 天津市人民医院，南开大学第一附属医院，天津 300121
2. Cangzhou People's Hospital, Cangzhou 061001, China;
3. Tianjin Union Medical Center, The First Affiliated Hospital of Nankai University, Tianjin 300121, China
急性心肌梗死（AMI）是一种严重威胁人类健康的心血管系统危急重症，临床上常通过药物溶栓或经皮冠状动脉介入术（PCI）等再灌注手段及时恢复心肌血流，以降低死亡率[1]。然而，再灌注治疗本身可诱发一种更为复杂的病理生理过程——心肌缺血再灌注损伤（MIRI）。MIRI不仅可能引发心律失常、心脏骤停等严重并发症，还会进一步扩大梗死面积，显著影响患者的远期预后[2]。因此，有效减轻MIRI已成为改善AMI患者预后的关键环节与挑战。MIRI的病理生理过程极为复杂，涉及氧化应激、炎症反应、钙超载、线粒体功能障碍、内皮功能障碍、铁死亡、细胞凋亡及自噬等多种机制的交互作用[3]。鉴于其机制的复杂性，单一靶点的治疗策略往往效果有限。在此背景下，中药凭借其多成分、多靶点的作用特点，在MIRI的防治中展现出独特优势，并已被证实具有积极疗效[4-5]。
葛根素（Puerarin，Pue；8-C-β-D-吡喃葡萄糖基-7，4-羟基异黄酮）是源自中药葛根的一种异黄酮化合物，具有广泛的心血管保护作用，如降血压、降脂和改善心肌供血等[6]。现有研究证实，Pue能够通过多靶点途径减少梗死面积、抑制氧化应激和炎症反应来发挥对MIRI的保护作用[7]。在MIRI的复杂调控网络中，过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）作为关键的核转录因子，在抑制炎症、细胞凋亡等方面发挥着核心作用[8]。前期研究证实，Pue能上调血管平滑肌细胞（VSMC）中PPARγ的表达以抑制炎症与细胞异常增殖[9]。PPARγ在心肌组织中也同样扮演着重要角色，Li等[10]的研究表明，Pue的心肌保护效应与激活PPARγ、抑制核因子κB（NF-κB）通路密切相关。然而，目前的研究多为相关性证据，即观察到Pue干预与PPARγ/NF-κB通路蛋白表达变化的同时发生，尚缺乏直接证据证明PPARγ是Pue在心肌细胞中发挥保护作用的必要靶点，其核心地位与因果关系仍不明确。
为填补这一关键空白，本研究聚焦于功能验证。选用经典的H9c2心肌细胞缺氧/复氧（H/R）模型模拟体内MIRI过程，并引入了小干扰RNA（siRNA）介导的基因敲低这一反向遗传学方法，通过特异性敲低PPARγ的表达，旨在直接检验以下假说：若PPARγ是Pue保护作用的核心分子靶点，那么在其功能缺失的情况下，Pue的保护效应应被显著削弱或逆转。研究旨在通过遗传学干预，为“Pue-PPARγ/NF-κB”通路在MIRI中的核心机制地位提供直接的功能性证据，为基于该靶点的药物开发与临床转化奠定坚实的实验基础。
1 材料与方法 1.1 细胞大鼠心肌H9c2细胞，来自天津市胸科医院心血管研究所。
1.2 药物与试剂Pue（3681-99-0，纯度98.92%）购自MedChemExpress公司；溶剂为二甲基亚砜（DMSO，D8370），购自Solarbio公司；胎牛血清（15140122）购自上海聚顶生物科技有限公司；DMEM培养基（C11995500BT）、0.25%胰蛋白酶（25200056）均购自美国Gibco公司；青链霉素混合物（15140122）购自Solarbio公司；RIPA裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒、PAGE凝胶快速制备试剂盒、双色预染蛋白Marker、电泳缓冲液、转膜缓冲液、TBST缓冲液等均购自上海雅酶生物科技有限公司；细胞计数试剂盒8（CCK-8）（CA1210）购自上海碧云天生物技术有限公司；PPARγ抗体（ab272718）、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗体（ab184787）均购自美国Abcam公司；白细胞介素-6（IL-6）（R0015c）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）（2856c）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（2435）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）抗体（18985）均购自武汉三鹰公司；磷酸化IκBα（Phospho-IκBα）抗体（2859）购自Cell Signaling Technology公司；siRNA转染试剂购自上海吉玛基因；二氧化碳（CO2）恒温培养箱（美国Thermo Fisher科技有限公司）；多功能酶标仪（美国Bio-Tek科技有限公司）；电泳仪及转膜仪（美国Bio Rad公司）。
1.3 细胞培养及H/R模型构建H9c2大鼠心肌细胞接种于含有10%胎牛血清和1%青链霉素混合物的DMEM培养基中，于37 ℃、95%氧气（O2）、5% CO2的恒温培养箱内进行培养。每日观察细胞生长状态，待细胞融合至85%~90%时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化，按1∶3的比例进行传代培养。
为模拟体内MIRI，本研究构建了H/R细胞模型。具体操作为：选择生长状态良好的对数生长期细胞，弃去原培养基，更换无糖培养基。随后，将细胞置于含1%O2、5%CO2及94%氮气（N2）的三气培养箱中缺氧孵育6 h[11]。完成缺氧后，再弃去无糖培养基，更换完全培养基，并将细胞移回标准培养条件（37 ℃，5% CO2）下复氧2 h，完成H/R模型的构建。
1.4 实验分组将H9c2细胞随机分为8组：对照组（control组）；缺氧复氧组（H/R组）；缺氧/复氧+ Pue低/中/高浓度组（H/R+25/50/100 μmol/L Pue组）；缺氧/复氧+Pue+siRNA NC组（H/R+Pue+NC组）；缺氧/复氧+Pue+siRNA组（H/R+Pue+si组）；缺氧/复氧+siRNA组（H/R+si组）。
其中，control组予以正常培养，不做任何处理；H/R组按1.3节所述方法进行缺氧6 h复氧2 h处理；H/R+Pue低、中、高剂量组分别加入浓度25、50、100 μmol/L的Pue预处理细胞12 h，随后进行H/R处理；H/R+Pue+NC组、H/R+Pue+si组分别转染非特异性siRNA、PPARγ特异性siRNA 6 h，转染后更换为含100 μmol/L Pue的培养基继续孵育12 h，最后进行H/R处理；H/R + si组转染PPARγ特异性siRNA 6 h，转染后更换为完全培养基孵育12 h，再进行H/R处理。
1.5 观察指标与检测方法 1.5.1 CCK-8法检测细胞活力以筛选Pue浓度将对数生长期的H9c2细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板，每孔加入100 μL完全培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24 h。待细胞贴壁后，随机分为6组进行处理：空白组（培养基、CCK-8，无细胞和药物）；control组（细胞、培养基、CCK-8，无药物）；Pue 25/50/100/200 μmol/L组（细胞、培养基、CCK-8、25/50/100/200 μmol/L Pue）。给药组分别加入相应浓度Pue后，继续培养12 h。培养结束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃避光孵育2 h。最后，使用酶标仪检测各孔在450 nm波长处的吸光度（OD值），计算细胞存活率，并筛选出低、中、高3个适宜浓度用于后续实验。细胞活力（%）=（[给药组OD值-空白组OD值）÷（control组OD值-空白组OD值）]×100%。
1.5.2 蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测蛋白表达各组H9c2心肌细胞经相应处理后，使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液于冰上裂解，以提取总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度，确保各样品浓度一致。随后，向蛋白样品中加入5×上样缓冲液，并于95 ℃金属浴中加热10 min使蛋白变性。取等量蛋白样品（30 μg）进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）以分离蛋白，电泳结束后，采用湿转法将凝胶上的蛋白转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。将PVDF膜置于含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中，室温摇床封闭2 h。封闭完成后，用TBST洗涤3次，每次10 min。随后加入Caspase-3、iNOS、PPARγ、p-IκBα及内参GAPDH一抗，于4 ℃摇床孵育过夜。第2天，回收一抗，并用TBST洗涤膜3次，每次10 min。加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h。二抗孵育结束后，再次用TBST洗涤3次，每次10 min。最后，滴加增强型化学发光（ECL）试剂于膜上，使用化学发光成像系统进行检测。采用Image J软件分析各目的条带的灰度值，并以GAPDH作为内参进行标准化。随后，以control组的均值为1进行归一化处理。使用GraphPad Prism 10.6.1软件进行统计分析及作图。
1.5.3 ELISA法检测细胞炎症因子IL-6和TNF-α水平各组H9c2心肌细胞经相应处理后，收集细胞培养上清液。将上清液于4 ℃、1 000 r/min条件下离心10 min（离心半径为6.5 cm），以彻底去除细胞碎片，取上清液分装后于-80 ℃冻存备用。随后严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，流程如下：将标准品和待测样品加入预包被的96孔板中，孵育后洗涤；依次加入生物素化抗体、HRP标记的链霉亲和素及TMB底物溶液，每步均需充分孵育和洗涤；最后加入终止液终止反应。用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度（OD值）。以标准品浓度为横坐标，其对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，并根据该曲线计算出各样品中IL-6和TNF-α的浓度。
1.5.4 siRNA转染采用Transfect-Mate转染试剂将siRNA转染至H9c2心肌细胞。将对数生长期的H9c2细胞接种于6孔板中，待细胞融合度达到50%~60%时进行转染。转染前，在无菌条件下将siRNA与Transfect-Mate试剂分别用无血清培养基（Opti-MEM）稀释，然后将两者混合，室温孵育15~ 20 min，以形成稳定的siRNA-转染试剂复合物。弃去原培养基，PBS洗涤两遍，每孔加入1 mL含10% 血清不含双抗培养基，随后将配置好的转染试剂逐滴加入孔中，轻轻摇匀。将细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育6 h。孵育结束后弃去转染试剂混合液的原培养基，PBS清洗3遍，更换为2 mL完全培养基，继续培养24 h以进行后续检测。
1.6 统计学方法运用GraphPad Prism 10.6.1软件进行数据处理与绘图。实验所有数据均采用均数±标准差（x±s）表示，组间差异采用单因素方差分析进行检验，P < 0.05被认为有统计学意义。
2 结果 2.1 Pue对H9c2心肌细胞活力的影响表 1结果显示，以control组为参照，25、50、100 μmol/L Pue处理组的细胞活力无显著降低（均维持在97%以上），说明该浓度范围内Pue对H9c2细胞无明显毒性。当Pue浓度升高至200 μmol/L时，细胞活力呈明显下降趋势（93.63%），提示该浓度Pue可能存在一定的细胞毒性。为排除药物潜在毒性对后续MIRI保护效应评价产生干扰，研究选择25、50、100 μmol/L这3个浓度作为后续实验的低、中、高Pue浓度。
| % | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | n | 细胞活力值 | |||||||||||||||||||||||||||
| control组 | 3 | 100.00±0.000 0 | |||||||||||||||||||||||||||
| 25 μmol/L Pue组 | 3 | 99.55±0.373 6 | |||||||||||||||||||||||||||
| 50 μmol/L Pue组 | 3 | 98.69±0.093 4 | |||||||||||||||||||||||||||
| 100 μmol/L Pue组 | 3 | 97.72±0.435 0 | |||||||||||||||||||||||||||
| 200 μmol/L Pue组 | 3 | 93.63±0.573 5 | |||||||||||||||||||||||||||
与control组相比，H/R组Caspase-3蛋白表达显著升高（P < 0.001）。与H/R组相比，Pue各浓度组Caspase-3蛋白表达均显著降低（P < 0.001），见图 1。
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| 注：图A，Caspase-3蛋白表达的Western blot分析；图B，Caspase-3蛋白相对表达量。与control组比较，***P < 0.001；与H/R组比较，###P < 0.001。 图 1 Pue对H/R H9c2心肌细胞IL-6、TNF-α水平的影响（x±s，n=3） |
与control组相比，H/R组iNOS蛋白表达显著升高（P < 0.001）。与H/R组相比，Pue各浓度组的iNOS蛋白表达均有不同程度降低（P < 0.001），见图 2。
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| 注：图A，iNOS蛋白表达的Western blot分析；图B，iNOS蛋白相对表达量。与control组比较，组比较，***P < 0.001；与H/R###P < 0.001。 图 2 Pue对H/R H9c2心肌细胞凋亡蛋白Caspase-3表达的影响（x±s，n=3） |
与control组相比，H/R组IL-6、TNF-α的表达水平明显升高（P < 0.001）。与H/R组相比，Pue各浓度组的IL-6、TNF-α的表达水平显著降低（P < 0.001），见图 3。
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| 注：图A，ELISA检测Pue不同浓度组细胞中IL-6水平的定量统计分析；图B，ELISA检测Pue不同浓度组细胞中TNF-α水平的定量统计分析。与control组比较，***P < 0.001；与H/R组比较，###P < 0.001。 图 3 Pue对H/R H9c2心肌细胞IL-6、TNF-α水平的影响（x±s，n=3） |
与control组相比，H/R组PPARγ蛋白表达降低、p-IκBα蛋白表达升高（P < 0.001）。与H/R组相比，Pue各浓度组的PPARγ的蛋白表达升高、p-IκBα蛋白表达降低（P < 0.001），见图 4。
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| 注：图水平的定量统计分析；图A，ELISA检测Pue不同浓度组细胞中IL-6水平的定量统计分析。与B，ELISA检测Pue不同浓度组细胞中TNF-α control组比较，***P < 0.001；与H/R组比较，###P < 0.001。 图 4 Pue对H/R H9c2心肌细胞PPARγ/NF-κB通路关键蛋白表达的影响（x±s，n=3） |
其中，高浓度组Pue对H9c2心肌细胞H/R损伤过程的PPARγ蛋白的上调和p-IκBα蛋白的下调作用最强，因此，后续实验选择100 μmol/L Pue进行研究。
2.6 敲低PPARγ处理对H/R过程中PPARγ/NF-κB通路的影响为了进一步验证NF-κB是PPARγ蛋白的下游通路，探讨Pue是否是通过PPARγ来调控p-IκBα的表达，从而发挥对H/R诱导的心肌细胞损伤的保护作用，本部分进行了基因沉默实验。采用siRNA转染实验敲低PPARγ，观察敲低PPARγ后NF-κB通路的激活情况，以及下游炎症因子的表达情况。
首先应用瞬时转染方法验证了PPARγ非特异性siRNA（siRNA NC）和4种PPARγ特异性siRNA（PPARγ-rat-487、PPARγ-rat-778、PPARγ-rat-832、PPARγ-rat-1187）对PPARγ在H9c2细胞中的敲低效率，序列如下表所示，见表 2。
| 基因 | 序列 |
| siRNA NC | sense: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′antisense5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ |
| PPARγ-rat-487 | sense: 5′-CCACAUGAAGAGCCUUCAATT-3′antisense5′-UUGAAGGCUCUUCAUGUGGTT-3′ |
| PPARγ-rat-778 | sense: 5′-GCGGAGAUCUCCAGUGAUATT-3antisense5′-UAUCACUGGAGAUCUCCGCTT-3′ |
| PPARγ-rat-832 | sense: 5′-GCCCUGGCAAAGCAUUUGUTT-3′antisense5′-ACAAAUGCUUUGCCAGGGCTT-3′ |
| PPARγ-rat-1187 | sense: 5′-CCUCCCUGAUGAAUAAAGATT-3′antisense5′-UCUUUAUUCAUCAGGGAGGTT-3′ |
结果显示，与siRNA NC组相比，4种PPARγ特异性siRNA对PPARγ蛋白均有不同程度的敲低（P < 0.001），其中，PPARγ-rat-832对PPARγ蛋白的敲低效率最高。因此，本研究选用PPAR γ-rat-832进行后续实验。见图 5。
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| 注：图A，不同siRNA转染组细胞中PPARγ蛋白表达的Western blot分析；图B，不同siRNA转染组PPARγ蛋白相对表达量。与NC组比较, ***P < 0.001。 图 5 siRNA干扰对H9c2心肌细胞PPARγ蛋白表达的敲低效率验证（x±s，n=3） |
敲低PPARγ后，各组PPARγ、p-IκBα蛋白表达变化如图 6所示。与control组相比，H/R组PPARγ蛋白表达降低、p-IκBα蛋白表达升高（P < 0.001）。与H/R组相比，H/R+si组进一步加剧了这一趋势，即PPARγ表达的进一步下调和p-IκBα表达的进一步上调，这再次证实了PPARγ-siRNA对PPARγ蛋白的敲低作用显著。
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| 注：图A，敲低PPARγ后，各组细胞中PPARγ、p-IκBα蛋白表达的蛋白相对表达量。与Western blot分析。图B，PPARγ蛋白相对表达量。图C，p-IκBα < 0.01control组比较，***P < 0.001；与H/R组比较，##P，###P < 0.001；与H/R+Pue+NC组比较，△△△P < 0.001。 图 6 敲低PPARγ对Pue调控PPARγ/NF-κB通路作用的影响（x±s，n=3） |
与H/R组相比，H/R+Pue+NC、H/R+Pue+si组PPARγ蛋白表达水平均有不同程度升高（P < 0.001和P < 0.01），p-IκBα蛋白表达水平均显著降低（P < 0.001）。此外，与H/R+Pue+NC组相比，H/R+Pue+si组PPARγ蛋白表达水平降低（P < 0.001），p-IκBα蛋白表达水平升高（P < 0.001）。
2.7 敲低PPARγ处理对H9c2心肌细胞炎症因子IL-6、TNF-α的影响结果显示，敲低PPARγ后，H/R+si组的炎症因子水平对比H/R组有进一步升高的趋势，再次印证了PPARγ-siRNA对PPARγ蛋白的敲低效果。
与H/R组相比，H/R+Pue+NC、H/R+Pue+si组的IL-6、TNF-α的表达水平均有明显下降（P < 0.001）。此外，与H/R+Pue+NC组相比，H/R+Pue+si组IL-6、TNF-α的表达水平升高（P < 0.001），见图 7。
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| 注：图A，敲低PPARγ后，ELISA检测各组细胞中IL-6水平的定量统计分析；图B，敲低PPARγ后，ELISA检测各组细胞中TNF-α水平的定量统计分析。与control组比较，***P < 0.001；与H/R组比较，##P < 0.001，###P < 0.001；与H/R+Pue+NC组比较，△△△P < 0.001。 图 7 敲低PPARγ对H/R H9c2心肌细胞IL-6、TNF-α水平的影响（x±s，n=3） |
Pue是中药葛根中含量最高的异黄酮类化合物[12-14]。中医理论认为，葛根性味甘辛平，具有升清降浊、通络除痹的功效，与胸痹“阳微阴弦”的病机相契合[15]，为其用于治疗心血管疾病提供了理论依据。现代药理学研究证实，Pue在抗心肌缺血、抗心律失常及改善心功能等方面发挥保护作用[6，16-18]。H9c2心肌细胞H/R模型是体外模拟MIRI的经典模型，已被广泛用于心肌保护机制的探索[11，19]。尽管已有研究提示Pue保护效应可能与PPARγ/NF-κB通路相关[10]，但在该模型中，Pue是否通过这一机制发挥保护作用尚缺乏功能性证据。基于此，本研究以H9c2心肌细胞为载体，通过缺氧6 h/复氧2 h（H/R）建立体外MIRI模型，验证Pue是否通过PPARγ/NF-κB通路发挥心肌保护作用。
本研究结果显示，与control组相比，H/R组处理显著上调了凋亡标志物Caspase-3、氧化应激相关蛋白酶iNOS及NF-κB通路相关蛋白p-IκBα蛋白表达水平，同时下调了PPARγ的表达，这与既往文献报道一致，表明模型构建成功，为后续机制探讨奠定了基础。
MIRI的病理生理过程复杂，主要涉及细胞凋亡、氧化应激和炎症级联反应等多个核心环节[20]。细胞凋亡是MIRI的核心特征之一，而Caspase-3作为凋亡途径下游的关键执行者和终末效应蛋白酶，其活化标志着细胞进入不可逆的凋亡阶段[21-23]。在MIRI的早期，再灌注会引发活性氧（ROS）的爆发，而心肌细胞在缺血应激下刺激iNOS表达，产生大量一氧化氮（NO）[24]，从而加剧氧化损伤并放大炎症反应[25]。PPARγ是一类配体激活的核转录因子，在抑制炎症和细胞凋亡中扮演重要角色[26]。NF-κB则是调控多种炎症基因转录的关键转录因子[27]。在静息状态下，NF-κB与抑制蛋白IκBα结合于细胞质中；当被激活时，IκBα发生磷酸化（p-IκBα）并降解，释放NF-κB入核，启动包括iNOS、TNF-α及IL-6在内的一系列下游促炎基因的转录[28]。因此，IκBα的磷酸化是NF-κB激活的关键上游事件，其表达水平可间接反映NF-κB通路的活化状态[29-30]。
本研究发现，Pue预处理能浓度依赖性地上调PPARγ蛋白表达，同时下调Caspase-3、iNOS、p-IκBα的蛋白水平以及IL-6、TNF-α的分泌。这一结果初步提示，Pue可能通过上调PPARγ蛋白表达，进而抑制下游NF-κB通路的过度激活，最终减轻H/R诱导的H9c2心肌细胞损伤。
为进一步验证PPARγ在Pue心肌保护效应中的关键作用，本研究采用siRNA基因沉默技术特异性敲低H9c2心肌细胞中PPARγ的表达。结果显示，PPARγ被敲低后，Pue对NF-κB通路关键蛋白p-IκBα及下游炎症因子IL-6、TNF-α的抑制效应被显著逆转。该结果证实，PPARγ是Pue经由NF-κB通路发挥抗炎与心肌保护作用的必要靶点，同时也首次在H9c2心肌细胞H/R模型中明确了“Pue-PPARγ/NF-κB”这一信号轴的核心调控地位。
值得关注的是，本研究观察到在PPARγ被敲低后，Pue的部分抗炎作用并未完全消失。这一现象提示Pue的心肌保护机制可能并非完全依赖于PPARγ通路，其作用网络中或存在PPARγ非依赖的补充途径，这与中药多靶点、多通路发挥协同效应的作用特点相符。已有研究报道，Pue可通过多种机制发挥心血管保护作用，例如通过SIRT1/NF-κB途径抑制炎症反应[31]；通过HES1介导的机制抑制自噬和细胞凋亡[32]；还可通过上调miR-21表达抑制细胞凋亡和氧化应激[33]。因此，在PPARγ信号通路被阻断的情况下，Pue可能通过其他一条或多条平行通路协同抑制NF-κB信号的过度激活，从而存在残余保护效应。综上，研究明确了PPARγ/NF-κB通路在Pue心肌保护效应中的核心地位，但同时也不排除Pue通过其他重要通路协同贡献其保护作用的可能性，这为后续深入探索其复杂的网络药理机制提供了线索。
研究仍存在若干局限性，需在后续研究中加以完善。首先，在检测方法上，主要通过Western blot技术评估关键蛋白的表达变化，尽管Caspase-3和iNOS分别是凋亡与氧化应激的常用分子标志物，但缺乏对凋亡率、ROS水平等指标的直接定量分析，未来可结合流式细胞术、TUNEL染色及荧光探针检测等方法，对上述指标进行更精准的量化评估；此外，对NF-κB通路激活状态的分析仅以p-IκBα的蛋白表达水平为依据，未检测p65核转位等直接激活证据，后续可通过免疫荧光染色结合Western blot等方法，进一步验证NF-κB通路的激活状态。其次，研究结论均基于H9c2心肌细胞系的体外实验结果，与体内环境的生理复杂性存在差异。为此，研究团队已启动大鼠MIRI模型的在体研究，通过多层次、多指标的实验设计，旨在更全面验证Pue是否通过相同机制在整体水平发挥保护作用，并系统评价其药效与安全性。最后，本研究仅聚焦于Pue单一单体成分，尽管该成分是葛根中的主要活性物质，但葛根中尚含有大豆苷元、大豆苷、β-谷甾醇等多种异黄酮类及其他活性成分，它们可能与Pue存在协同或拮抗作用，共同影响整体药效。此外，Pue体外有效浓度向临床生药等效剂量的转化涉及生物利用度、体内代谢与分布等多个环节，是衔接基础研究与临床应用中亟待解决的重要问题。因此，未来的研究应从单一单体拓展至葛根提取物乃至含葛根的经典复方，系统比较其与单体成分在心肌保护中的综合效应，并深入阐明其网络药理机制，从而为中药的现代化与精准临床转化提供更坚实的科学依据。
4 结论研究不仅确证了Pue通过PPARγ/NF-κB轴保护心肌细胞免受H/R损伤的分子机制，也为开发基于PPARγ靶点的心血管保护新策略提供了实验依据。尽管研究在细胞水平取得了进展，但其结论仍需在整体动物模型中进一步验证。因此，后续研究将聚焦于在MIRI动物模型中验证Pue-PPARγ/NF-κB轴的体内疗效，并开展临床前安全性评价及给药系统优化研究，为其最终的临床转化奠定基础。
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