2026, Vol. 45文章信息
- 王静, 贾晓旭, 张怡博, 李非凡, 朱金墙, 郑文科
- WANG Jing, JIA Xiaoxu, ZHANG Yibo, LI Feifan, ZHU Jinqiang, ZHENG Wenke
- 基于肠道菌群初步探讨半夏秫米汤改善失眠的作用机制
- Preliminary exploration of the mechanism by which Banxia Shumi Decoction improves insomnia based on the gut microbiota
- 天津中医药大学学报, 2026, 45(6): 689-699
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2026, 45(6): 689-699
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2026.06.09
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文章历史
收稿日期: 2026-02-15
引用本文 |
2. 鄂尔多斯中医医院药剂科，鄂尔多斯 017010
2. Department of Pharmacy, Ordos Hospital of Traditional Chinese Medicine, Ordos 017010, China
失眠是指入睡困难、睡眠时间减少以及睡眠质量下降，进而引起记忆力、注意力下降的一种常见的睡眠障碍[1]。长期失眠不仅会导致免疫力下降、内分泌紊乱等，还会诱发焦虑、抑郁等不良情绪[2-3]。流行病学研究显示，中国15~69岁的居民中有35.7% 出现睡眠质量不佳的症状[4]。失眠已经成为当今社会普遍的健康问题之一。目前常用于治疗失眠的药物主要包括苯二氮卓类、非苯二氮卓类等，这两类药会导致非机械肠梗阻、健忘、梦游等不良反应[5]。因此，寻找安全有效治疗失眠的方法迫在眉睫。
中医认为失眠属于“不寐”“卧不安”之范畴，治则以健脾和胃、安神助眠为法[6]。在中医整体观念的指导下通过辨证论治，运用具有多成分、多靶点等特点的中药治疗失眠，可以标本兼治且副作用小，存在一定优势[7]。半夏秫米汤（简称BXSM）出自《黄帝内经·灵枢邪客第七十一》，为治疗不寐证之祖方，被誉为“治疗失眠第一方”[8]。方中半夏辛温，燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结，能交通阴阳、安神而治疗失眠[9]；秫米甘寒，可以安心神，也有安神和胃、除湿祛风的效果，两药合用，可燥湿化痰、通利中焦、引阳入阴、调和营卫而安神，具有良好的镇静催眠作用[10]。
失眠的发生与肠道菌群失调、中枢神经递质、下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴、炎症因子等有关[11-12]。肠道菌群可以影响脑内神经递质如5-羟色胺（5-HT）、γ-氨基丁酸（GABA）的合成与释放[13-15]。有研究表明[16]，与正常组相比，失眠患者的肠道菌群多样性显著减少。并且肠道菌群与睡眠存在双向调控，睡眠剥夺可加剧肠道屏障损伤及菌群紊乱[17]，而菌群代谢产物亦可反向调节下丘脑-垂体-肾上腺轴[18]。因此，调节肠道菌群是防治失眠的有效途径之一。
研究通过腹腔注射对氯苯丙氨酸（PCPA）联合水平台法建立小鼠失眠模型，通过16S rRNA高通量测序分析失眠小鼠肠道菌群的物种组成以及丰富度的变化，考察BXSM对失眠小鼠行为学、肠屏障蛋白表达水平、结肠中白细胞介素-6（IL-6）含量、下丘脑病理损伤及其5-HT、GABA含量和离子钙结合衔接分子-1（Iba-1）表达的影响，初步探讨BXSM抗失眠的作用机制，为其临床应用提供科学依据。
1 材料 1.1 实验动物SPF级C57BL/6JNifdc雌性小鼠（18~20 g）北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SYXK（京）2021-0006。本实验严格遵守实验动物管理与使用，并获得天津中医药大学伦理委员会批准（批号：TCM-LAEC2024 113f1128）。
1.2 试剂与仪器PCPA（默克）、生半夏（中药材创新联盟）、秫米、艾司唑仑片（山东信谊制药有限公司）、苏木精-伊红染色（HE）高清恒染试剂盒、组织固定液、无水乙醇、二甲苯、组化试剂盒3，3’-二氨基联苯胺（DAB）显色剂、柠檬酸抗原修复剂、脱蜡液、磷酸盐缓冲液（PBS）、3%过氧化氢消毒液、牛血清白蛋白（BSA）、Iba-1（武汉赛维尔生物有限公司）、闭锁小带蛋白-1（ZO-1，艾比玛特）、闭合蛋白（Occludin，武汉三鹰）、密封蛋白-5（Claudin-5，武汉三鹰）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（武汉赛维尔生物有限公司）。
离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司），脱水机（杭州迪英加科有限公司）、包埋机（武汉俊杰电子有限公司）、病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）、正置荧光显微镜（日本尼康）、成像系统（日本尼康）。
2 方法 2.1 药物制备方法BXSM：按1∶2称取生半夏与秫米，加10倍体积冷水浸泡1 h，加热煮沸后煎煮1 h，浓缩至生药浓度为10 g/mL，置于4 ℃冰箱避光保存备用。阳性药：艾司唑仑片加蒸馏水配制成0.005 g/mL，置于4 ℃冰箱避光保存备用。PCPA：加入适量1 mol/L氢氧化钠将生理盐水pH调节至7，PCPA粉末溶于调节好pH的生理盐水中，再加入适量吐温80助溶，配制浓度为40 mg/mL，置于4 ℃冰箱保存备用。
2.2 模型制备与给药分组：将60只雌性小鼠随机分为空白组（K组）、模型组（M组）、阳性药组（Y组）、半夏秫米汤低剂量组（BXSM-D组）、半夏秫米汤中剂量组（BXSM-Z组）、半夏秫米汤高剂量组（BXSM-G组）。
造模：除K组外，将其他组的小鼠每天腹腔注射PCPA（400 mg/kg）后放入水平台中，水平台中的水每天更换两次，连续造模3 d。小鼠造模后观察一般状态，发现小鼠昼夜节律失调，毛发杂乱无光泽，并且精神萎靡，表明小鼠的失眠模型制备成功。
给药：BXSM和艾司唑仑剂量为临床用药剂量，人和小鼠用药量根据《药理实验方法学》[19]中的剂量换算方法，BXSM-D组、BXSM-Z组和BXSM-G组分别按照13、26、52 g（/kg·d）灌胃给药BXSM，Y组按照0.75 mg（/kg·d）剂量灌胃给予艾司唑仑，K组和M组灌胃给予等体积生理盐水。
2.3 旷场实验末次给药1 h后开始实验。旷场实验前将小鼠放入实验房间适应30 min。通过与旷场箱连接的分析系统，将旷场箱均分为9个小格，包括1个中心区域和8个四周区域，小鼠在箱中适应1 min，记录5 min内的总路程、平均速度、站立次数和静止时间作为评价指标。每只小鼠实验结束后，清理旷场箱中的粪便及尿液，用75%乙醇擦拭旷场箱底面及四周并晾干，去除上1只小鼠的气味。
2.4 16 s rRNA微生物多样性测序按照MagPure Soil DNA LQ Kit试剂盒说明书对小鼠粪便样本基因组DNA进行提取。再利用NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific）和琼脂糖凝胶电泳检测小鼠粪便DNA的浓度和纯度，将提取的小鼠粪便DNA保存于-20 ℃。以提取的基因组DNA为模板，使用带Barcode的特异引物和Takara Ex Taq高保真酶进行细菌16S rRNA基因的PCR扩增。
2.5 样本采集小鼠腹腔注射1.25%三溴乙醇（0.1 mL/g）进行麻醉，摘眼球取血，静止2 h，3 500 r/min（离心半径为15.5 cm）离心15 min，吸取上清，置于-80 ℃冰箱中保存。心脏灌注，取脑组织，每组分别取3只全脑用4%多聚甲醛固定，其余分离下丘脑、海马组织、皮质，置于-80 ℃冰箱中保存。取结肠，用生理盐水冲洗，置于-80 ℃冰箱中保存。
2.6 免疫荧光观察结肠紧密连接蛋白ZO-1依次将切片放入环保型脱蜡液Ⅰ-环保型脱蜡液Ⅱ-环保型脱蜡液Ⅲ-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-无水乙醇Ⅲ-蒸馏水洗。抗原修复：自然冷却后将玻片置于PBS（pH7.4）中在摇床上晃动洗涤每次5 min共3次。阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%双氧水溶液，室温下避光孵育25 min，将玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。在组化圈内滴加3% BSA全部覆盖组织，室温封闭30 min。甩掉封闭液，在切片上滴加用PBS稀释好的ZO-1（1∶50）一抗，放于湿盒内4 ℃孵育过夜。玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的荧光二抗（1∶500）覆盖组织，室温孵育60 min。玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加含DAPI的封片剂封片，荧光显微镜下进行结果判读。
2.7 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测小鼠结肠组织Occludin、Claudin 5蛋白表达每组随机取3只小鼠的结肠样本，匀浆，离心吸取上清液，BCA法测定蛋白浓度，加入5×还原型蛋白上样缓冲液，100 ℃水浴10 min。上样电泳，转膜，TBST清洗，封闭，加入Occludin（1∶20 000）、Claudin 5（1∶20 000）、β-actin（1∶5 000）抗体，4 ℃过夜，TBST清洗，加入二抗室温孵育2 h，TBST清洗。ECL发光液曝光显影，Image J分析条带。
2.8 酶联免疫吸附法（ELISA）检测下丘脑5-HT、GABA和结肠IL-6含量根据ELISA试剂盒说明书的使用方法测定小鼠下丘脑中的5-HT、GABA和结肠IL-6的含量。
2.9 HE染色观察小鼠脑组织形态学变化脑组织固定48 h后，放入脱水盒中梯度乙醇依次进行脱水，将组织放入石蜡中进行包埋并冷却。冷却好的石蜡块置于石蜡切片机上切片。依次将切片放入环保型脱蜡液Ⅰ-环保型脱蜡液Ⅱ-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-75%酒精，自来水下冲洗。切片放入高清恒染预处理液中处理1 min。苏木素染色：切片置于苏木素染液中染色3~5 min，自来水冲洗-分化液分化-自来水冲洗-返蓝液返蓝-自来水冲洗。伊红染色：切片放入95%的酒精脱水1 min，置于伊红染液中染色15 s。脱水封片：切片依次放入无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-无水乙醇Ⅲ-正丁醇Ⅰ-正丁醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ透明，晾干二甲苯后中性树胶封片。显微镜镜检并采集图像。
2.10 免疫组化观察小鼠脑中小胶质细胞依次将切片放入环保型脱蜡液Ⅰ-环保型脱蜡液Ⅱ-环保型脱蜡液Ⅲ-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-无水乙醇Ⅲ-蒸馏水洗。抗原修复，自然冷却后将玻片置于PBS中在摇床上晃动每次5 min共洗涤3次。阻断内源性过氧化物酶：在3%双氧水溶液中室温避光孵育25 min放入，将玻片置于PBS中在摇床上晃动每次5 min共洗涤3次。在组化圈内滴加3% BSA室温封闭30 min。轻轻甩掉BSA，在切片上滴加用PBS稀释好的一抗（1∶300），切片平放于湿盒内，将湿盒放在4 ℃孵育过夜。玻片置于PBS中在摇床上晃动每次5 min共洗涤3次。切片轻轻甩干后在圈内滴加与一抗相应种属按照1∶200的比例配制辣根过氧化酶标记（HRP）均匀的覆盖组织，在室温下孵育一抗50 min。玻片置于PBS中在摇床上晃动洗涤每次5 min共3次。切片轻轻甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，放置于自来水中终止显色。苏木素复染3 min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。将切片依次放入75%酒精-85%酒精-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-正丁醇-二甲苯Ⅰ中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来后晾干，用封片胶进行封片。在白光显微镜下进行结果判读并拍照分析。
2.11 统计学方法所有数据均以均数±标准差（x±s）表示，采用GraphPad Prism 8.0对实验结果进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05代表数据有统计学意义。
3 结果 3.1 半夏秫米汤对小鼠行为学的影响如图 1，与K组相比，M组小鼠的总路程、平均速度和站立次数均显著下降（P < 0.05），静止时间显著上升（P < 0.05）；与M组相比，Y组小鼠的总路程显著增加（P < 0.05）、平均速度呈上升趋势（P > 0.05）、静止时间有所减少（P > 0.05）、站立次数显著增多（P < 0.05）；BXSM-D组总路程、平均速度和站立次数有上升的趋势（P > 0.05），静止时间有所减少（P > 0.05）；BXSM-Z组总路程、站立次数和平均速度显著增加（P < 0.05）、静止时间显著减少（P < 0.05）；BXSM-G组站立次数显著增多（P < 0.05）、总路程和平均速度有所上升（P > 0.05），静止时间有所减少（P > 0.05）。
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| 注：图A，行为轨迹图；图B，总路程；图C，平均速度；图D，静止时间；图E，站立次数。与K组比较，*P < 0.05；与M组比较，#P < 0.05。 图 1 小鼠行为学结果（x±s，< n =10） |
Specaccum物种累积曲线可用来判断样本量是否足够并估计群落丰富程度，横坐标代表样本量，纵坐标代表被检测的物种数。如图 2A所示样本数量大于1 500，表明样本中的物种已经被充分检测，能够比较具体的反应小鼠肠道中的菌群分析。
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| 注：图A，Specaccum物种累积曲线图；图B，肠道菌群ASV花瓣图；图C，ACE；图D，Chao1；图E，Observed Species；图F，NMDS分析；图G，门水平菌群组；图H，目水平菌群组；图I，科水平菌群组成；图K，K组；图M，M组；图Y，Y组；图D，BXSM-D组；图Z，BXSM-Z组；图G，BXSM-G组。 图 2 肠道菌群分析各组小鼠差异菌群分析 |
如图 2B，扩增子序列变体（ASV）代表小鼠肠道内菌群的丰富度，ASV越高，肠道菌群的丰富度就越高。ASV分析结果显示，K组、M组、Y组、BXSM-D组、BXSM-Z组、BXSM-G组分别有538、432、590、519、512、590个ASV。与K组相比，M组的ASV个数明显减少Y组、BXSM-D组、BXSM-Z组、BXSM-G组都对肠道菌群的丰富度有所改善。
3.2.3 beta多样性分析非度量多维排列（NMDS）分析通常不受样本距离的数值影响，一般认为应力值（Stress）小于0.2时，NMDS分析的结果较可靠。如图 2C所示，NMDS分析模型的Stress值为0.056，表明本研究的NMDS分析模型较可靠。与M组相比，BXSM-D组、BXSM-Z组、BXSM-G组和Y组更接近K组。
3.2.4 alpha多样性分析稀释曲线趋于平坦表明本次测序结果已足够反映当前样本所包含的多样性。在相同测序深度下，稀释曲线越高表明各组的样本数量越多。如图 2D、E、F，K组和BXSM给药组基于丰度的覆盖估计值（ACE）、Chao 1指数（Chao 1）和观测物种数（Observed Species）多数高于M组。
3.2.5 肠道菌群物种相对丰度水平及差异分析在门水平上，如图 2G，肠道菌群主要物种组成拟杆菌门（Bacteroiota）、厚壁菌门（Firmicutes），其次是变形菌门（Proteobacteria）、脱铁杆菌门（Deferribacterota）、脱硫杆菌门（Desulfobacterota）、放线菌门（Actinobacteriota）、弯曲杆菌门（Campilobacterota）、梭杆菌门（Fusobacteriota）、芽单胞菌门（Germnatimonadota）、髌骨细菌门（Patescibacteria）、黏球菌门（Myxococcota）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、蓝藻菌（Cyanobacteria）和其他（others）。在门水平上，与K组相比，M组小鼠肠道中的Bacteroiota和Firmicutes平衡失调，使得肠黏膜受损，导致肠道炎症，BXSM各给药组改善了平衡。
在目水平上，如图 2H，肠道菌群主要的物种组成为：拟杆菌目（Bacteroidales）、毛螺菌目（Lachnospirales）、颤螺菌目（Oscillospirales）、乳杆菌目（Lac‐tobacillales）、梭菌纲_UCG-014（Clostridia_UCG-014）、伯克霍尔德菌目（Burkholderiales）、丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）、脱铁杆菌目（Deferribacterales）、脱硫弧菌目（Desulfovibrionales）、梭菌纲_vadinBB60组（Clostridia_vadinBB60_group）、消化链球菌目-蒂西菌目（Peptostreptococcales-Tissierellales）、肠杆菌目（Enterobacterales）、红螺菌目（Rho‐dospirillales）、弯曲菌目（Campylobacterales）、柯巴尔菌目（Coriobacteriales）和其他（others）。在目水平上，与K组相比，M组Bacteroidales上调，各给药组回调了该菌群的水平。
在科水平上，如图 2I，肠道菌群主要的物种组成为：鼠杆菌科（Muribaculaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、理研菌科（Rikenellaceae）、普雷沃菌科（Prevotellaceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、乳杆菌科（Lactobacilliaceae）、梭菌_UCG-014组（Clostridia_UCG-014）、颤螺菌科（Oscillospiraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、[真杆菌]_产粪甾醇菌群（[Eubacterium]_coprostanoligenes_group）、萨特菌科（Sutterellaceae）、脱铁杆菌科（Deferribacteraceae）、曼尼菌科（Marinifilaceae）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）、脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）和其他（others）。在科水平上，与K组相比，M组的下调了Lachnospiraceae水平，BXSM各给药组上调了该菌群。
3.2.6 LEfse分析根据LEfse分析，如图 3显示P < 0.05，LDA > 2的差异物种。K组的优势菌群为g__Roseburia、f__Burkholderiaceae、g__Lautropia、g__ Romboutsia、g__Prevotellaceae_NK3B31_group、g__Faecalibaculum、f__Coriobacteriaceae、g__Collinsella、g__ Helicobacter、c__Campylobacteria、p__Campilobacterota、f__Helicobacteraceae、o__Campylobacterales、g__ Turicibacter、g__Agathobacter。与K组相比，M组的优势菌群有f__Rikenellaceae、g__Rikenellaceae_RC9_ gut_group、f__Bacteroidaceae、g__Bacteroides、g__Ali‐stipes、o__Enterobacterales、f__Enterobacteriaceae、c__ Alphaproteobacteria、o__Rhodospirillales、g__Escherichia_Shigella、g__Robinsoniella、g__Clostridioides。与M组相比，Y组的优势菌群有g__Lachnospiraceae_NK4A136_group、g__Lachnospiraceae_UCG_001、g___Eubacterium__siraeum_group、g__Family_XIII_ UCG_001、g__Faecalibaculum、g__Dubosiella、g__Romboutsia、g__Lachnoclostridium、o__Peptostreptococcales_Tissierellales、f__Anaerovoracaceae、c__Actinobacteria、g__Butyricicoccus、g__Bifidobacterium、f__Bifidobacteriaceae、o__Bifidobacteriales；BXSM-D组的优势菌群有g__Ruminococcus、g__Faecalibaculum、g__Clostridioides、g__Neisseria、f__Neisseriaceae、g__ Porphyromonas、f__Porphyromonadaceae、c__Campylobacteria、p__Campilobacterota、o__Campylobacterales、g__Helicobacter、f__Helicobacteraceae、o__Peptostreptococcales_Tissierellales、p__Actinobacteriota、f__ Peptostreptococcaceae、g__Romboutsia、c__Coriobacteriia、o__Coriobacteriales；BXSM-Z组的优势菌群有g__Romboutsia、g__Faecalibacterium、o__Pasteurellales、g__Haemophilus、f__Pasteurellaceae；BXSM-G组的优势菌群有p__Firmicutes、c__Clostridia、f__Lachnospiraceae、o__Lachnospirales、o__Oscillospirales、f__ Oscillospiraceae、g__Romboutsia、g__Lachnospiraceae_UCG_001、g__A2、g__Family_XIII_UCG_001、g__Lachnoclostridium、g__Colidextribacter、g__Oscillibacter、g__Blautia、c__Desulfovibrionia、f__Desulfovibrionaceae、o__Desulfovibrionales、p__Desulfobacterota、f__Butyricicoccaceae、g__Bilophila、g__GCA_900 066575、g__Desulfovibrio。
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| A 图 3 肠道菌群分析各组小鼠差异菌群分析 |
Y组回调了g__Faecalibaculum；BXSM-D回调了g__Faecalibaculum、c__Campylobacteria、p__Cam‐pilobacterota、o__Campylobacterales、f__Helicobacteraceae；BXSM-Z回调了g__Romboutsia。
3.3 半夏秫米汤对小鼠结肠紧密连接蛋白ZO-1表达水平的影响免疫荧光结果显示，K组小鼠结肠组织细胞核（蓝色荧光）清晰可见，细胞结构完整，无明显损伤或炎症迹象；紧密连接蛋白ZO-1（绿色荧光）线条均匀连续分布在细胞边界，表明紧密连接完好无损，肠道屏障功能正常。与K组小鼠相比，M组小鼠结肠组织细胞核排列紊乱，黏膜层结构呈现不同程度的破坏，绿色荧光信号明显减弱，且呈现不连续点状或斑片状分布，严重损伤区域细胞间隙异常增宽。给药组的结肠细胞核形态趋于规则，碎片化现象减少，细胞核排列密度接近正常组水平。Image J量化分析显示，相较于M组，BXSM-Z组显著上调了ZO-1表达水平。见图 4。
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| 注：与K组比较，#P < 0.05；与M组比较，*P < 0.05。图A，ZO-1荧光图；图B，ZO-1荧光量化结果。 图 4 小鼠结肠组织ZO-1荧光表达及量化（x±s，n=3） |
Western blot结果显示，与K组相比，M组Claudin-5的表达显著降低（P < 0.05），Occlucin表达降低（P > 0.05）；BXSM-D组Claudin-5表达有所增加（P > 0.05），BXSM-Z组、BXSM-G组的Claudin-5表达显著增加（P < 0.05），BXSM各给药组的Occlucin的表达有所增加（P > 0.05）。见图 5。
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| 注：图A，Occlucin；图B，Claudin-5。与K组比较，*P < 0.05；与M组比较，#P < 0.05。 图 5 失眠小鼠肠屏障蛋白表达（x±s，n=3） |
与K组相比，M组的5-HT和GABA的含量明显减少（P < 0.05）；与M组相比，Y组的5-HT含量有所增加（P > 0.05），GABA含量显著增加（P < 0.05）；BXSM-D组与BXSM-G组的5-HT和GABA含量显著增加（P < 0.05）；BXSM-Z组的5-HT含量显著增加（P < 0.05），GABA含量有所增加（P > 0.05）。与K组相比，M组结肠中IL-6含量显著增加（P < 0.05）；Y组以及BXSM-D、BXSM-Z、BXSM-G组的结肠IL-6含量显著减少（P < 0.05）。见图 6。
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| 注：图A，5-HT；图B，GABA；图C，IL-6。与K组比较，*P < 0.05；与M组比较，#P < 0.05。 图 6 小鼠下丘脑5-HT、GABA和结肠IL-6含量（x±s，n=4） |
HE结果显示，K组脑组织结构比较正常，细胞排列紧凑，染色清晰，没有明显的坏死；与K组相比，M组小鼠细胞排列松散，染色不均匀，细胞间隙变大；与M组相比，BXSM-D、BXSM-Z、BXSM-G组和Y组细胞间隙变小，排列相对整齐。见图 7。
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| 注：图A，K组；图B，M组；图C，Y组；图D，BXSM-D组；图E，BXSM-Z组；图F，BXSM-G组。 图 7 小鼠HE染色（x±s，< n =3，×20） |
免疫组化结果显示，K组下丘脑中小胶质细胞数量占比较少，细胞大小均一；与K组相比，M组小鼠Iba-1表达显著增多（P < 0.05）；与M组相比，BXSM-D和Y组Iba-1表达减少（P > 0.05）；BXSM-Z组和BXSM-G组Iba-1表达显著减少（P < 0.05），表明BXSM可抑制小鼠下丘脑中小胶质细胞的活化。见图 8。
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| 注：图A，K组；图B，M组；图C，Y组；图D，BXSM-D组；图；与E，BXSM-Z组；图F，BXSM-G组；图G，免疫组化量化。与K组比较，*P < 0.05 M组比较，#P < 0.05。 图 8 小鼠免疫组化及量化结果（x±s，< n =3，×20） |
失眠会对人们的生活工作产生影响，并且时常伴有抑郁、焦虑等不良情绪。陈燕等[20]发现失眠后小鼠运动轨迹稀释、活动减少。本实验通过腹腔注射PCPA联合水平台法制备小鼠失眠模型，PCPA是色氨酸羟基酶抑制剂，色氨酸羟化酶是合成5-HT的起始酶和限速酶[21]，实验结果显示造模后5-HT含量显著下降；旷场实验结果显示失眠小鼠的活动总路程、平均速度、站立次数减少、静止时间增加，与陈燕等的研究结果一致，表明失眠模型建立成功。
《黄帝内经》提出“胃不和则卧不安”，“不得卧而息有音者，是阳明之逆也……阳明者，胃脉也，胃者，六腑之海，其气亦下行，阳明逆不得从其道，故不得卧也。”表明失眠与“胃”的功能密切相关。现代研究表明，肠道菌群可通过免疫调节通路、神经内分泌通路和迷走神经通路3条途径影响大脑功能：首先是肠道微生物通过免疫调节通路与免疫细胞相互作用，调节细胞因子（例如炎症因子）等的分泌从而影响大脑功能；其次肠道微生物能通过通过调节皮质醇、色氨酸、5-HT等神经递质的分泌影响下丘脑-垂体-肾上腺轴和中枢神经系统；最后肠道菌群及其代谢产物还可以通过迷走神经影响大脑和睡眠[21]。另有研究发现，失眠患者肠道菌群丰度会减少[22]，肠道菌群及其代谢产物能够调节肠道循环，作用于中枢系统，引起神经系统生理病理变化[23]。许珂等[24]测定失眠老人粪便中的短链脂肪酸发现，失眠可能是由丙酸短链脂肪酸激活游离脂肪酸转运蛋白3，促进释放去甲肾上腺素，增加觉醒的次数所导致，表明失眠与肠道菌群有关。为了验证BXSM对肠道菌群的影响，笔者采用16S rRNA高通量测序的方法对小鼠肠道菌群进行了分析，失眠小鼠肠道菌群的菌群丰富度相较于K组显著减少，给药后肠道菌群丰富度明显增加；在Alpha多样性分析中发现，M组的ACE、Chao 1和Observed Species指数低于K组和给药组，说明在BXSM治疗后能改善失眠小鼠肠道菌群的丰富度。
此外，肠道菌群紊乱会导致肠道炎症的发生[25-26]，神经递质是肠菌代谢的产物之一[35]，不仅对胃肠道有影响，还对睡眠调节尤为关键，其中5-HT和GABA作为两种至关重要的抑制性神经递质，在大脑情绪、睡眠与觉醒平衡中发挥重要作用[36]。有研究发现5-HT和GABA的生成与肠道中的乳杆菌属、嗜热链球菌属以及双歧杆菌有关[37-38]，并且肠道菌群还通过代谢产物，如SCFAs调节神经元从而控制5-HT和GABA的水平[39]。除此之外5-HT通过激活多种受体亚型（如5-HT1A受体和5-HT2A受体），调节下游神经元活动[40-41]。提高5-HT水平有助于延长睡眠时间，改善失眠，缓解失眠引起的抑郁、焦虑等不良情绪[42]；GABA是一种抑制性神经递质，抑制神经元过度兴奋，从而起到助眠作用[43]，通过激活GABAA受体和GABAB受体，对中枢神经系统产生抑制作用[44]。临床发现失眠患者在治疗后，GABA含量上升，睡眠时间延长，失眠症状明显减轻[45]。动物实验发现失眠小鼠脑中的5-HT和GABA含量下降[46-47]。本实验失眠小鼠5-HT和GABA含量亦明显下降，与其他研究结果一致，并且BXSM能够回调因失眠引起的5-HT和GABA含量下降。
综上所述，本实验发现BXSM可能通过调节肠道菌群，降低肠道炎症水平，改善肠道屏障，从而减少小胶质细胞活化数量，调节神经递质释放，改善小鼠失眠。尽管本研究为BXSM治疗失眠提供了部分依据，但由于失眠病理机制极其复杂，BXSM治疗失眠的具体机制还有待进一步研究。
| [1] |
乔明亮, 梁硕, 孟毅, 等. 柴胡皂苷A调节cAMP/PKA/CREB信号通路对失眠大鼠的改善作用及机制研究[J]. 中药新药与临床药理, 2024, 35(5): 633-638. |
| [2] |
Chapagai S, Fink AM. Cardiovascular diseases and sleep disorders in South Asians: A scoping review[J]. Sleep Medicine, 2022, 100: 139-149. DOI:10.1016/j.sleep.2022.08.008 |
| [3] |
HERRERO BABILONI A, BARIL A A, CHARLEBOIS‐PLANTE C, et al. The Putative Role of Neuroinflammation in the Interaction between Traumatic Brain Injuries, Sleep, Pain and Other Neuropsychiatric Outcomes: A State‐of‐the‐Art Review[J]. J Clin Med, 2023, 12(5): 1793. DOI:10.3390/jcm12051793 |
| [4] |
ZHENG B, YU C, LYU J, et al. Insomnia symptoms and risk of cardiovascular diseases among 0.5 million adults: A 10‐year cohort[J]. Neurology, 2019, 93(23): e2110-e2120. |
| [5] |
来峰. 卒中后睡眠障碍评价指标的研究进展[J]. 临床神经病学杂志, 2024, 37(6): 451-455. |
| [6] |
傅芳浩. 观察健脾愈胃汤与常规西药疗法联用对胃溃疡合并失眠患者不良反应、睡眠质量及效果的影响[J]. 世界睡眠医学杂志, 2023, 10(5): 1015-1017. |
| [7] |
张天元, 杨莹莹, 崔书克. 失眠的中西医研究进展[J]. 中国中医药现代远程教育, 2023, 21(10): 196-199. |
| [8] |
杨嫚, 刘西建, 张艳. 半夏秫米汤镇静催眠作用的实验研究[J]. 山东中医杂志, 2019, 38(10): 974-977. |
| [9] |
张经北, 管风玲, 刘蕾, 等. 应用半夏治疗失眠的研究进展[J]. 内蒙古中医药, 2022, 41(12): 163-165. |
| [10] |
王芳, 张君奇, 喻军海, 等. 半夏秫米汤加减治疗伴失眠的抑郁障碍的临床研究[J]. 药品评价, 2022, 19(12): 735-737. |
| [11] |
曹亿诺, 李烁, 孙莉琼, 等. 清心益智助眠药枕基础方对失眠小鼠心脏、肝脏及脑组织的影响[J]. 南京农业大学学报, 2025, 48(2): 321-329. |
| [12] |
SEN P, MOLINERO‐PEREZ A, O'RIORDAN KJ, et al. Microbiota and sleep: awakening the gut feeling[J]. Trends Mol Med, 2021, 27(10): 935-945. DOI:10.1016/j.molmed.2021.07.004 |
| [13] |
LI H, WANG Y, ZHAO C, et al. Fecal transplantation can alleviate tic severity in a Tourette syndrome mouse model by modulating intestinal flora and promoting serotonin secretion[J]. Chin Med J (Engl), 2022, 135(6): 707-713. DOI:10.1097/CM9.0000000000001885 |
| [14] |
YANO JM, YU K, DONALDSON GP, et al. Indigenous bacteria from the gut microbiota regulate host serotonin biosynthesis[J]. Cell, 2015, 161(2): 264-76. DOI:10.1016/j.cell.2015.02.047 |
| [15] |
YUNES RA, POLUEKTOVA EU, DYACHKOVA MS, et al. GABA production and structure of gadB/gadC genes in Lactobacillus and Bifidobacterium strains from human microbiota[J]. Anaerobe, 2016, 42: 197-204. DOI:10.1016/j.anaerobe.2016.10.011 |
| [16] |
LIU B, LIN W, CHEN S, et al. Corrigendum: Gut Microbiota as an Objective Measurement for Auxiliary Diagnosis of Insomnia Disorder[J]. Front Microbiol. 11, 510. |
| [17] |
WANG Z, CHEN WH, LI SX, et al. Gut microbiota modulates the inflammatory response and cognitive impairment induced by sleep deprivation[J]. Mol Psychiatry, 2021, 26(11): 6277-6292. DOI:10.1038/s41380-021-01113-1 |
| [18] |
WANG Z, WANG Z, LU T, et al. Gut microbiota regulate insomnia‐like behaviors via gut‐brain metabolic axis[J]. Mol Psychiatry, 2025, 30(6): 2597-2611. DOI:10.1038/s41380-024-02867-0 |
| [19] |
徐叔云. 药理实验方法学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1982: 1861.
|
| [20] |
陈燕, 许晓丽, 陈亚萍, 等. 半夏秫米汤对失眠大鼠下丘脑5-HT介导的cAMP/CREB/BDNF通路的影响[J]. 中药药理与临床, 2024, 40(10): 10-14. |
| [21] |
夏天吉, 闫明珠, 王智, 等. 大小鼠失眠模型和评价方法研究进展[J]. 中国实验动物学报, 2022, 30(3): 428-435. |
| [22] |
黄倩, 曾霖, 王高祥, 等. 基于微生物-肠-脑轴理论中医调节肠道菌群治疗失眠研究进展[J]. 天津中医药, 2022, 39(4): 538-544. |
| [23] |
AGRAWAL R, AJAMI NJ, MALHOTRA S, et al. Habitual Sleep Duration and the Colonic Mucosa‐Associated Gut Microbiota in Humans‐A Pilot Study[J]. Clocks Sleep, 2021, 3(3): 387-397. DOI:10.3390/clockssleep3030025 |
| [24] |
许珂, 蔡丽伟, 周书喆, 等. 自拟平衡针灸通过调控PI3K-AKT信号通路及血清GABA水平对老年失眠的治疗作用[J]. 中国老年学杂志, 2024, 44(2): 338-342. |
| [25] |
MAGZAL F, EVEN C, HAIMOV I, et al. Associations between fecal short‐chain fatty acids and sleep continuity in older adults with insomnia symptoms[J]. Sci Rep, 2021, 11(1): 4052. DOI:10.1038/s41598-021-83389-5 |
| [26] |
FENG W, YANG Z, LIU Y, et al. Gut microbiota: A new target of traditional Chinese medicine for insomnia[J]. Biomed Pharmacother, 2023, 160: 114344. DOI:10.1016/j.biopha.2023.114344 |
| [27] |
WANG Z, WANG Z, LU T, et al. The microbiota‐gut‐brain axis in sleep disorders[J]. Sleep Med Rev, 2022, 65: 101691. DOI:10.1016/j.smrv.2022.101691 |
| [28] |
苏浩. 从TLR4/MyD88/NF-κB通路探讨交泰丸改善失眠大鼠肠道炎症和通透性的机制研究[D]. 武汉: 华中科技大学, 2019.
|
| [29] |
史敏, 赵欢, 李钊颖, 等. 基于肠道菌群介导的短链脂肪酸调节小胶质细胞极化探讨黄连温胆汤加减方对失眠大鼠的影响[J]. 现代中西医结合杂志, 2024, 33(17): 2342-2352. |
| [30] |
MATHIAS K, MACHADO RS, STORK S, et al. Short‐chain fatty acid on blood‐brain barrier and glial function in ischemic stroke[J]. Life Sci, 2024, 354: 122979. DOI:10.1016/j.lfs.2024.122979 |
| [31] |
IMHANN F, VILA A V, BONDER M J, et al. Interplay of host genetics and gut microbiota underlying the onset and clinical presentation of inflammatory bowel disease[J]. Gut, 2018, 67(1): 108-119. DOI:10.1136/gutjnl-2016-312135 |
| [32] |
JAMES A S, CHAUDHARI D S, JAIN S, et al. Specific Microbiome Signature Dynamics CouldPredict Aging Continuum and Cognitive Impairment in Older Adults[J]. Physiology, 2024, 39(S1). |
| [33] |
ZHANG J, SONG L, WANG Y, et al. Beneficial effect of butyrate‐producing Lachnospiraceae on stress‐induced visceral hypersensitivity in rats[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2019, 34(8): 1368-1376. DOI:10.1111/jgh.14536 |
| [34] |
MORISSETTE A, ANDRÉ DM, AGRINIER AL, et al. The metabolic benefits of substituting sucrose for maple syrup are associated with a shift in carbohydrate digestion and gut microbiota composition in high‐fat high‐sucrose diet‐fed mice[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2023, 325(6): E661-E671. DOI:10.1152/ajpendo.00065.2023 |
| [35] |
王梦锦. 九华黄精均一多糖的结构表征及改善糖尿病的作用机制研究[D]. 合肥: 安徽中医药大学, 2025.
|
| [36] |
陆乐. 基于肠脑轴探究肠道菌群在镉致大鼠认知障碍中的作用[D]. 扬州: 扬州大学, 2025.
|
| [37] |
LI R, PAN Y, JING N, et al. Flavonoids from mulberry leaves exhibit sleep‐improving effects via regulating GABA and 5‐HT receptors[J]. J Ethnopharmacol, 2025, 337(Pt 3): 118734. |
| [38] |
P STRANDWITZ, KH KIM, D TEREKHOVA, et al. GABA ‐modulating bacteria of the human gut microbiota[J]. Nat Microbiol, 2019, 4(3): 396-403. |
| [39] |
JM YANO, K YU, GP DONALDSON, et al. Indigenous bacteria from the gut microbiotaregulate host serotonin biosynthesis[J]. Cell, 2015, 161(2): 264-276. DOI:10.1016/j.cell.2015.02.047 |
| [40] |
SHOUBRIDGE A P, CHOO J M, MARTIN A M, et al. The gut microbiome and mental health: Advances in research and emerging priorities[J]. Mol Psychiatry, 2022, 27(4): 1908-1919. DOI:10.1038/s41380-022-01479-w |
| [41] |
SUN Y, ZHANG N, QU Y, et al. Shuangxia decoction alleviates p‐chlorophenylalanine induced insomnia through the modification of serotonergic and immune system[J]. Metab Brain Dis, 2020, 35(2): 315-325. DOI:10.1007/s11011-019-00499-w |
| [42] |
PHILIPPE T J, VAHID‐ANSARI F, DONALDSON Z R, et al. Loss of MeCP2 in adult 5‐HT neurons induces 5‐HT1A autoreceptors, with opposite sex‐dependent anxiety and depression phenotypes[J]. Sci Rep, 2018, 8(1): 5788. DOI:10.1038/s41598-018-24167-8 |
| [43] |
WANG W, WANG Y, GUO Q, et al. Valerian essential oil for treating insomnia via the serotonergic synapse pathway[J]. Front Nutr, 2022, 9: 927434. DOI:10.3389/fnut.2022.927434 |
| [44] |
ZHU S, NOVIELLO CM, TENG J, et al. Structure of a human synaptic GABAA receptor[J]. Nature, 2018, 559(7712): 67-72. DOI:10.1038/s41586-018-0255-3 |
| [45] |
VARINTHRA P, ANWAR S N, SHIH S C, et al. The role of the GABA ergic system on insomnia[J]. Tzu Chi Med J, 2009, 36(2): 103-109. |
| [46] |
王苇, 周汝宁, 郝丽丽. 脑卒中后睡眠障碍患者血清NSE, IL-1β及5-HT水平的变化及意义[J]. 中国实用神经疾病杂志, 2021, 24(8): 714-719. |
| [47] |
顾永芳, 李劲草, 薛瑞, 等. 百灵龙枣安神方对环境应激诱导失眠大鼠的睡眠改善作用及其机制[J]. 中国药理学与毒理学杂志, 2025, 39(5): 321-331. |