2026, Vol. 45文章信息
- 张程, 王炳权, 戴宇祥, 王拥军, 孙悦礼
- ZHANG Cheng, WANG Bingquan, DAI Yuxiang, WANG Yongjun, SUN Yueli
- 探讨芪麝丸及其有效成分延缓髓核细胞衰老的机制研究
- Exploring the mechanism of Qishe Pills and its active component in delaying intervertebral disc degeneration and nucleus pulposus cell senescence: A study based on network pharmacology and experimental validation
- 天津中医药大学学报, 2026, 45(6): 700-708
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2026, 45(6): 700-708
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2026.06.10
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文章历史
收稿日期: 2025-12-26
引用本文 |
2. 上海交通大学医学院附属第六人民医院针推伤科，上海 200032;
3. 南京中医药大学附属苏州市中医医院，苏州 215009
2. Department of Acupuncture and Moxibustion Tuina Traumatolog, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200032, China;
3. Department of Orthopedics, Suzhou TCM Hospital affiliated to Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Suzhou 215009, China
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
椎间盘退变（IVDD）是脊柱退行性疾病的核心病理过程之一，也是导致慢性腰背痛及神经功能障碍的主要原因。其病理机制涉及椎间盘结构的进行性破坏，包括髓核脱水、纤维环裂隙形成、终板软骨退变以及炎症微环境的激活[1]。这些变化不仅削弱椎间盘的力学支撑功能，还可能引发椎间盘突出、椎间隙狭窄及邻近神经根或脊髓受压，进而导致持续性疼痛、肢体麻木、活动受限等一系列临床症状。随着全球人口老龄化进程加速、久坐生活方式普及以及肥胖率上升，IVDD的发病率显著增加。流行病学数据显示[2]，约40%的30岁以上人群存在IVDD的影像学表现，60岁以上人群中这一比例高达80%以上。
IVDD在中医理论中可归属于“腰痛”“骨痹”筋伤”等范畴，其病理演变具有渐进性特点，是多因素共同作用的结果。《素问·脉要精微论》言：“腰者，肾之府，转摇不能，肾将惫矣。”明确指出腰部筋骨病变与肾脏功能密切相关。《素问·宣明五气》强调：“久立伤骨，久行伤筋。”提示慢性劳损是加速退变的重要诱因。
芪麝丸是国医大师施杞的经验方，其在临床应用广泛，具有益气化瘀、祛风通络、舒筋止痛的作用。用于缓解轻、中度神经根型颈椎病气虚血瘀证出现的颈项部疼痛或不适，上肢放射性疼痛、上肢麻木，神疲乏力等症状。根据芪麝丸的药代动力学等相关研究进展发现[3]，在人体中可测到青藤碱、木兰花碱、汉防己甲素等8种有效成分，并且对气虚血瘀体质的志愿者有明显的治疗作用。王拥军等[4]通过建立动静力失衡性颈椎间盘退变模型，结合逆转录多聚酶链式反应方法检测出相比活血通络方与芬必得，芪麝颈康丸可以在椎间盘组织内抑制碱性成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子的表达，并上调胰岛素样生长因子的表达，从而调控髓核细胞的功能。
综上，芪麝丸具有无创、无痛、副作用低的治疗优势，在防治IVDD具有较好的潜力，虽然基于前期的相关实验研究已证实芪麝丸相关成分在调控髓核细胞凋亡、抑制炎症起到关键作用，但对于衰老方向的研究以及相关激活通路尚不明确。
1 材料与方法 1.1 芪麝丸延缓椎间盘退变的网络药理学研究 1.1.1 芪麝丸生物活性化合物的筛选与鉴定通过中药系统药理学数据库[5]（TCMSP，https://www.tcmsp-e.com/）、中药分子机制生物信息学分析工具[6]（BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batmantcm）、TCM-Suite[7]（http://tcm-suite.aimicrobiome.cn）、SymMap[8]（http://www.symmap.org）及中药整合数据库（TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid/），以“黄芪”“防己”“川芎”“牛黄”“青风藤”“麝香”为关键词，筛选与芪麝丸相关的靶标化合物。将各化合物名称输入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获取其标准SMILES结构式，并通过瑞士ADME平台[9]（http://www.swissadme.ch）进行药物相似性分析，筛选标准为“胃肠道吸收=高”且“药物相似性（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muege）中至少两项满足要求”。
1.1.2 芪麝丸抗IVDD治疗靶点的预测通过TCMSP平台获取成分靶标，同时将化合物结构式输入瑞士靶标预测平台[10]（http://www.swisstargetprediction.ch）。结合DrugBank数据库整合后，所有靶标名称通过UniProt数据库[11]（https://sparql.uniprot.org）进行标准化。以“Intervertebral disc degeneration”为关键词，检索GeneCards（https://www.lifemapsc.com/）、OMIM（https://www.omim.org）及DisGeNET[12]（http://www.disgenet.org）疾病数据库筛选IVDD相关靶标。
1.1.3 疾病靶点收集、蛋白互作网络（PPI）构建及核心靶点筛选将药物靶点及疾病靶点交集导入STRING 11.5数据库[13]（https://string-db.org），获得PPI蛋白互作图，利用Cytoscape 3.9.0重建PPI网络，并根据度值筛选核心靶标。
1.1.4 基因组百科全书（KEGG）通路富集分析、基因本体（GO）功能富集分析使用metascape网站（https://metascape.org）进行富集分析GO分析和KEGG分析，分别富集生物过程，分子功能及细胞组成，进行后续分析验证。
1.2 芪麝丸有效成分与IVDD核心靶点的分子对接及可视化 1.2.1 分子处理流程使用AutoDock Tools 1.5.7对从PubChem获取的芪麝丸关键成分进行分子预处理，生成含极性氢的PDBQT文件；核心靶点蛋白结构来源于Alphafold，去除水分子和配体，添加Kollman电荷后保存为PDBQT格式，通过PyMOL 2.5.2精确定义活性口袋坐标，确保对接位点准确。
1.2.2 分子对接步骤及可视化分子对接采用AutoDock Vina 1.2.3，结合PyMOL分析氢键、疏水作用等相互作用，筛选结合能≤-5.0 kcal/mol的稳定复合物。使用LigPlot+ 2.2.4生成二维互作图，明确关键残基，验证网络药理学预测结果。
1.3 芪麝丸有效成分延缓髓核细胞衰老的细胞实验 1.3.1 原代髓核细胞提取新生乳鼠（< 7日龄）经75%乙醇处死后无菌取尾椎，磷酸缓冲盐溶液（PBS）漂洗3次，剪碎组织。加入含3 mg/mL Ⅱ型胶原酶（P5755103，Gibco）的消化液，37 ℃消化4~6 h。细胞滤筛过滤后离心（1 500 r/min，离心半径为13.7 cm，3 min），沉淀用含10% 胎牛血清（FBS，A5670701，Gibco）、1%青链霉素（15070063，Gibco）的杜氏改良Eagle培养基（DMEM）培养基重悬，贴壁培养24 h后换液，传代至10 cm皿扩增。上述动物实验方案经上海中医药大学动物伦理委员会批准，批准文号为PZSHUTCM221010004。
1.3.2 衰老模型建立及给药第3代细胞接种至6孔板，1组进行70%汇合时更换含梯度叔丁基过氧化氢（TBHP）的完全培养基，诱导4 h后更换为完全培养基继续培养至24 h造模，1组进行含梯度TBHP的完全培养基持续干预24 h造模，确定造模浓度及方式后加入细胞给药，并用75 μmol/L浓度的LY294002（154447-36-6，MCE）作为通路抑制剂进行24 h干预作为通路抑制剂组。将全部细胞分为对照组、TBHP造模组（简称造模组）、汉防己甲素给药组、通路抑制剂组。
1.3.3 细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测药物毒性髓核细胞接种于96孔板，每孔约1×104个细胞，培养24 h至细胞贴壁。根据文献，查找备选的4个药物合适的给药浓度，并设置多个浓度，用培养基稀释备用。弃去原培养基，按浓度梯度加入含药培养基，每浓度设6复孔，继续培养24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，避光孵育2 h。用酶标仪测定450 nm处吸光度，计算各浓度下的细胞存活率，确定药物的安全浓度，从而验证合适的给药浓度。1.3.4衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色细胞干预结束后，弃培养基，PBS轻柔漂洗3次。每孔加入1 mL 4%多聚甲醛（Beyotime，P0099），室温固定15 min。每孔加入1 mL染色工作液，37 ℃避光孵育16 h，光学显微镜（Eclipse Ti2，Nikon）下观察并采集图像。衰老细胞胞质呈深蓝绿色颗粒状染色，阴性细胞无明显显色。
1.3.5 免疫荧光染色4%多聚甲醛固定15 min，0.1% Triton X-100透膜10 min。5% BSA封闭1 h，一抗稀释比1∶300，加入一抗胶原蛋白Ⅱ型（COL2A1，28459-1-AP，proteintech）、磷酸化蛋白53（p53，10442-1-AP，proteintech）、磷酸化蛋白21（p21，28248-1-AP，proteintech），磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（p-PI3K，AF3242，affinity），磷酸化AKT蛋白（pAKT，9272S，CST）4 ℃孵育过夜。分别用标记二抗1∶500避光孵育1 h，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核5 min，显微镜观察并拍照。
1.3.6 蛋白免疫印迹（Western blot）检测放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液提取蛋白，双喹啉甲酸（BCA）法定量，蛋白经SDS-PAGE电泳转至PVDF膜，快速封闭液（P0252，beyotime）封闭15 min。一抗1∶1 000稀释，以p53、p214 ℃孵育过夜。二抗室温孵育1 h，增强型化学发光试剂（ECL）显影，ImageJ分析灰度值。
1.3.7 统计学方法所得实验数据借助Graphpad prism 10.3.1软件进行统计学分析及作图，以单因素方差分析进行统计分析。本研究的各项数据显示为均数±标准差（x±s）。P < 0.05表示差异具有统计学意义（ns表示差异无统计学意义；*表示P < 0.05；**表示P < 0.01；***表示P < 0.001）。
2 结果 2.1 芪麝丸延缓椎间盘退变的网络药理学研究 2.1.1 交集靶点、富集分析与核心靶点网络图将芪麝丸含有黄芪、防己、青风藤、川芎、牛黄和麝香的六种药物，检索公共数据库获得789个活性成分，筛选后保留480种活性化合物，通过TCMSP、SwissTargetPrediction（筛选条件可能性大于0.2）、DrugBank等平台进行检索，去重获得1362个药物成分靶点。通过GeneCards、OMIM和DisGeNET等疾病数据库检索并去重得到7 589个与IVDD相关的潜在靶点。经过交集分析，共获得319个芪麝丸与IVDD共有的潜在作用靶点，这些共有靶点可能在芪麝丸治疗IVDD的过程中发挥关键作用，后续将进一步通过PPI网络分析筛选核心靶点。将交集靶点导入Metascape，其富集分析显示，在KEGG结果中可见衰老相关通路如PI3K/AKT通路、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）通路、p53通路都呈现较高的度值，另外炎症性通路如IL-17通路也发挥了相当重要的作用。生物过程GO富集分析中淋巴祖细胞分化、磷代谢过程的正向调节、激素反应、生长因子反应、细胞迁移的正向调节等生物过程重要性较高，生物成分GO富集分析中，芪麝丸干预IVDD的过程与胞体，受体复合物，胞质核周区，膜侧，突触后，突出后膜，细胞外基质，黏着斑，转录调节复合物等细胞成分有重要联系，分子功能GO富集分析中，药物作用可能会着重影响如DNA结合转录因子结合，蛋白激酶活性，激酶结合，细胞因子受体结合，蛋白同源二聚化活性，泛素样蛋白连接酶结合，细胞黏附分子结合等分子功能。具体见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。
将靶点导入String网站获得原始PPI互作关系，导入Cytoscape后进行核心靶点分析，根据degree值排序其核心靶点见OSID。其中度值排行前3分别是表皮生长因子受体（EGFR）、Jun原癌基因（JUN）、TP53。结合椎间盘疾病的特点，本研究聚焦髓核细胞衰老进行研究，针对富集而得的p53通路及TP53基因进行相关研究，并且在通路富集中发现PI3K/AKT通路发挥了相当重要的作用，后续验证药物对于髓核细胞衰老的治疗作用，并探索其通路上下游关系。
2.1.2 “药物-成分-靶点-通路-疾病”分析结果综合以上数据库结果，整合药物-成分-靶点-通路-疾病网络该网络由305条连接线构成，其中度值较高的核心成分包括槲皮素（Quercetin）、大豆黄酮（Daidzein）等，其可能在芪麝丸治疗IVDD过程中起主要作用，度值较高的通路包括PI3K/Akt信号通路、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路等，与前文富集结果大致一致，度值较高的基因包括雌激素受体1基因（ESR1）、EGFR、凝血因子Ⅱ基因（F2）等基因见OSID。
2.1.3 药物活性成分与预测靶点分子对接根据前期芪麝丸研究已经发现其拥有19种含量较高较稳定的成分：没食子酸（Gallic acid）、青藤碱（Sinomenine）、毛蕊异黄酮苷（Calycosin）、毛蕊异黄酮苷（Calycosin-7-O-β-D-glucoside）、四氢表小檗碱（Tetrahydroepiberberine）、汉防己甲素（Tetrandrine）、延胡索乙素（Tetrahydropalmatine）、防己诺林碱（Fangchinoline）、黄藤素（Palmatine）、洋川芎内酯Ⅰ（Senkyunolide Ⅰ）、5-O-甲基维斯阿米醇（5-O-Methylvisamminol）、芒柄花苷（Ononin）、黄豆素、芒柄花素（Formononetin）、黄芪甲苷Ⅳ（Astragaloside Ⅳ）、胆酸（Cholic acid）、黄芪甲苷Ⅲ（Astragaloside Ⅲ）、川芎内酯A（Senkyunolide A）及黄连素（Berberine）[14-15]。
将芪麝丸质谱分析成分结果的结合“成分-靶点-通路网络图”中成分的高度值成分，取交集并加上高预测值的成分获得芪麝丸发挥主要作用的核心成分16种，与核心靶点前6种进行分子对接实验，见图 1A，筛选出结合能最高的有效成分化合物分子。结果可知汉防己甲素、芒柄花苷、延胡索乙素及黄藤素为结合能最高的有效成分，可能是芪麝丸延缓IVDD的核心有效成分，因TP53为细胞衰老核心靶点基因，将4种结合能最高的有效成分与TP53进行分子对接可视化展示，见图 1B。
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| 注：图A，16种潜在活性成分与6个核心靶点的分子对接结合能热图，颜色由黄至紫表示结合能由高到低，数值越低表示结合能力越强；图B，结合能较高的代表性活性成分与核心靶点TP53的分子对接可视化结果，包括2D相互作用图及3D结合模式图，展示配体与氨基酸残基之间的相互作用情况。 图 1 分子对接及可视化 |
采用SA-β-gal染色设置浓度梯度及时间梯度，分别对照TBHP 25、50、75及100 μmol/L浓度下髓核细胞染色情况，对比TBHP干预4 h后更换正常细胞继续培养20 h与TBHP完整干预24 h的染色结果进行对比，在浓度梯度测试中可见，在TBHP浓度上升至75 μmol/L时，细胞出现了较明显的衰老，上升至100 μmol/L时，细胞出现明显死亡，数量下降，相较于干预4 h再继续培养，24 h连续干预后，细胞的衰老造模较为可观，故后续选用75 μmol/L TBHP干预24 h作为造模条件，如图 2A。
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| 注：图A，不同浓度TBHP处理细胞4 h和24 h后的衰老情况（SA-β-gal染色，蓝色为阳性细胞），比例尺=20 μm；图B，不同浓度汉防己甲素、芒柄花苷、延胡索乙素及黄藤素对细胞活力的影响（CCK-8法）。与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；ns表示差异无统计学意义。 图 2 TBHP诱导细胞衰老模型的建立及不同活性成分对细胞活力的影响（x±s，n=3） |
分子对接预测可知汉防己甲素、芒柄花苷、延胡索乙素及黄藤素为可能的有效成分，而后进行了CCK-8药物安全浓度测试，如图 2B所示。根据实验结果可知，汉防己甲素的安全给药浓度为1 μmol/L，芒柄花苷的安全给药浓度上限为1 μmol/L，延胡索乙素的安全给药浓度上限为40 μmol/L，黄藤素的安全给药浓度上限为8 μmol/L。
2.2.2 有效单体实验验证以安全给药浓度的最高给药上限为上述4种单体分别设置3个给药浓度进行干预，观察含对照组、造模组共计14组的结果。如图 3所示，在TBHP干预下，Western blot实验显示造模组p53及p21两个主要的通路指标都有显著的提高，而在4种不同的药物干预下，汉防己甲素药效稳定，且显著降低了通路指标的提高，针对本实验与p53/p21通路的靶向研究目的，笔者选取汉防己甲素作为后续研究的单体药物。
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| 注：图A，各组细胞中蛋白相对表达量的灰度值分析（以p53及p21蛋白表达水平的Western blot条带图，β-actin作为内参蛋白；图B，p53及p21β-actin为内参进行归一化）。与对照组比较，**P < 0.01，***P < 0.001；与造模组比较，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001；ns表示差异无统计学意义。 图 3 单体干预对p53/p21通路相关蛋白表达的影响（x±s，n=3） |
通过细胞免疫荧光染色对COL2A1、p-PI3K、p-AKT、p53和p21蛋白表达进行检测，分为对照组、造模组、汉防己甲素给药组、PI3K通路抑制剂组共4组。如图 4结果显示：与对照组相比，TBHP造模组COL2A1、p-PI3K和p-AKT表达明显降低，而衰老相关蛋白p53与p21的表达水平显著升高；给予汉防己甲素干预后，COL2A1、p-PI3K和p-AKT蛋白表达显著回升，且p53和p21蛋白表达明显下降，表明汉防己甲素可能通过激活PI3K/AKT信号通路而抑制p53通路活性，从而缓解髓核细胞衰老；进一步地，PI3K通路抑制剂组中COL2A1、p-PI3K和p-AKT表达明显降低，而p53和p21蛋白表达水平再度升高，提示汉防己甲素的保护作用可能主要依赖于PI3K/AKT信号通路的激活。
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| 注：图蛋白表达的免疫荧光结果；红色或绿色荧光表示目标蛋白表达，蓝色（A，各组髓核细胞中COL2A1、磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化AKT（p-AKT）、p53及p21 DAPI）表示细胞核，比例尺=20 μm；图B，各组蛋白表达水平的定量分析（基于荧光强度）。与造模组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；ns表示差异无统计学意义。 图 4 汉防己甲素干预后PI3K/AKT信号通路及细胞衰老相关蛋白表达的免疫荧光验证（x±s，n=3） |
综上所述，本实验结果表明汉防己甲素对髓核细胞衰老具有明显的治疗潜力，并可能通过调节PI3K/AKT与p53通路实现保护作用。
3 讨论随着年龄增长或在应力等因素作用下，椎间盘细胞会经历衰老，表现为增殖能力下降、分泌功能改变等。这些变化会导致细胞外基质成分的失衡，如胶原和蛋白聚糖的减少，进而削弱椎间盘的机械性能。此外，衰老细胞会分泌促炎性细胞因子，加剧局部炎症反应，进一推动椎间盘退变的进程[16]。
先前研究表明，p53分子高表达及通路在椎间盘退变前后存在显著差异[17]，通过核因子κB（NF-κB）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路促进基质金属蛋白酶（MMPs）和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶（ADAMTS）的表达，导致细胞外基质降解[18-19]，或调控胶原Ⅱ和聚集蛋白聚糖的表达，从而影响细胞外基质的稳态[20]。参与多种生物过程，如通过激活Bcl-2相关X蛋白（Bax）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）通路促进椎间盘细胞调控细胞衰老和凋亡，通过共济失调-毛细血管扩张突变体蛋白/共济失调-毛细血管扩张及Rad3相关蛋白（ATM/ATR）信号通路感应DNA损伤并加剧IVDD进程[21]。而氧化应激及炎症信号的高表达可以促进p53的高表达[22]，并且与炎症形成正反馈循环，加速椎间盘的退变。因p53在椎间盘中的重要作用，故存在较高的治疗潜力，抑制p53能够减少椎间盘细胞的凋亡，延缓IVDD[23-24]。槲皮素、白藜芦醇等天然化合物通过沉默信息调节因子1（SIRT1）信号通路抑制p53表达，减少椎间盘细胞凋亡和衰老[25-26]。
本研究利用网络药理学及分子对接等生信分析对芪麝丸与椎间盘退变的作用关系进行了深入定义分析，通过KEGG富集分析，直观证明了细胞衰老通路在IVDD过程中占据重要位置，以及汉防己甲素等核心有效成分延缓了IVDD。但在生信分析中也存在一些不足之处，一方面是网络药理学的公共数据库存在误差较高，另一方面应该在于针对椎间盘无血管组织的特性，需增加证据力度，如深入增加靶器官质谱，以证明药物成分切实到达靶器官内。
在细胞实验中，深入探索了髓核细胞衰老的分子机制是由PI3K/AKT/p53通路在调控细胞周期、凋亡及衰老中发挥核心作用。PI3K的激活可促使AKT磷酸化，进而激活鼠双微体基因2（MDM2）的胞核转移与稳定表达，MDM2作为p53的E3泛素连接酶，可促使p53泛素化并降解，从而负向调控p53活性[27]。因此，PI3K/AKT通路的上调通常伴随p53水平的下调，进而延缓细胞衰老。反之，当PI3K/AKT信号受抑或MDM2功能缺失时，p53积聚将促使p21等下游效应蛋白上调，启动细胞周期阻滞并诱导衰老。
细胞实验还证实了汉防己甲素在延缓髓核细胞衰老方面的显著作用，并揭示了其可能通过PI3K/AKT/p53信号轴发挥调控作用，从而实现既有靶向结合，又通过信号调控p53与表达下调，两种方式协同延缓髓核细胞衰老的过程。此研究为后续深入探讨汉防己甲素治疗IVDD的分子机制及其临床应用前景提供了实验依据。同时，其他潜在有效成分如芒柄花苷、延胡索乙素亦显示出一定调控作用，值得在更广泛机制背景下进一步挖掘。
4 结论研究基于网络药理学结果，证明了芪麝丸在IVDD过程中作用的核心疾病靶点与富集的相关通路，发现芪麝丸可以延缓IVDD，显著改善表型，并主要通过p53通路延缓IVDD和髓核细胞衰老。通过体外实验证明芪麝丸延缓IVDD可能与PI3K/AKT通路相关，筛选有效成分后，发现汉防己甲素作为复方有效成分可以通过上游PI3K/AKT/MDM2通路抑制p53通路延缓IVDD和髓核衰老。因此，证明了芪麝丸及汉防己甲素可以被认为可以延缓IVDD的髓核细胞衰老进程。
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