2026, Vol. 45文章信息
- 龚浩然, 赵鑫伟, 王凯, 倪道艳, 崔梦圆, 刘政源, 姜月, 张琳琳
- GONG Haoran, ZHAO Xinwei, WANG Kai, NI Daoyan, CUI Mengyuan, LIU Zhengyuan, JIANG Yue, ZHANG Linlin
- 益肾化浊方调控CREB/BDNF通路改善学习记忆及神经元突触可塑性的机制研究
- Based on the CREB/BDNF pathway: Investigation of the effects of the kidney-benefiting and turbidityresolving formula on learning, memory, and neuronal synaptic plasticity
- 天津中医药大学学报, 2026, 45(6): 709-716
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2026, 45(6): 709-716
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2026.06.11
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文章历史
收稿日期: 2026-02-08
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2. 天津中医药大学第二附属医院，天津 300250
2. The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300250, China
阿尔茨海默病（AD）又被称为老年性痴呆，是老年人群体最为常见的认知障碍疾病类型，以认知障碍、精神行为异常和社会活动及生活能力下降为主要临床表现[1]。目前中国AD的发病人数多达1 500万，且发病率呈现逐年升高的趋势[2]，根据预测，到2030年中国AD男、女性发病人数将分别增长89.74%和105.06%[3]，由此造成的经济负担与社会影响堪忧。AD起病隐匿、进展性加重，中后期将伴随不可逆的脑实质损害[4]，因此，AD早期被认为是干预的黄金时期，对延缓AD的发生发展有着重要意义。
AD的发病机制复杂，主要与β淀粉样蛋白（Aβ）的过度沉积、tau蛋白的异常磷酸化、神经元突触功能障碍、神经元凋亡及炎症反应等影响因素密切相关[5]。其中突触功能障碍被认为与AD的发病，尤其是与患者学习记忆能力的减退关系密切[6]。近些年来，通过对突触功能障碍的调节，改善海马突触可塑性进而改善AD患者认知功能的策略得到了广泛认同[7-8]。在对突触可塑性的调节中，“环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）/脑源性神经营养因子（BDNF）信号通路”发挥了重要作用[9]。
团队在著名中医脑病专家张伯礼院士提出的益肾化浊法治疗痴呆的基础上，结合本院脑病针灸中心长期临床实践，总结出了益肾化浊方（简称YHD）以治疗AD患者，取得满意疗效。该方由酒女贞子、制何首乌、淫羊藿、肉苁蓉、石菖蒲和川芎6味中药组成。团队前期临床研究显示该方可明显改善轻度AD患者的认知功能、精神行为、日常生活能力及中医证候，尤其对即刻回忆、延迟回忆及语言等方面作用效果显著[10]。文章通过体内实验，观察YHD对早期痴呆动物模型行为学、神经突触形态、突触神经电生理功能及“CREB/BDNF信号通路”相关蛋白表达的影响，以期探讨该方防治AD的可能作用机制，为后续深入机制研究提供参考。
1 材料 1.1 动物模型3月龄雄性健康SPF级快速老化易感系8型小鼠（SAMP8）12只，体质量20~30 g；同月龄3月龄雄性SPF级SPF级抵抗快速老化R1系小鼠（SAMR1）24只，体质量20~30 g。动物均由北京大学医学部（实验动物科学部）提供，实验动物质量合格证号：SCXK（京）2022-0009，饲养于北京晶莱华科生物技术有限公司动物中心。明暗交替12 h/12 h，室温23~25 ℃，相对湿度为50%~60%，自由摄食饮水。实验中所有操作均符合《实验动物管理与使用指南》[11]，研究符合天津中医药大学动物伦理委员会要求，动物实验伦理批号TCM-LAEC2022042。
1.2 药物YHD中药颗粒剂组成：酒女贞子（批号：21100500）10 g，淫羊藿（批号：21100266）10 g，肉苁蓉（批号：21100451）10 g，制何首乌（批号：21100516）6 g，石菖蒲（批号：21100625）6 g，川芎（批号：21100634）6 g，上述药物均于天津中医药大学第二附属医院中药房一次性购买。
1.3 主要实验试剂D-葡萄糖（西格玛，货号：080M0142V），电镜固定液（索莱宝，货号：P1126），EPON812包埋液（西格玛，货号：45345），彩虹180广谱蛋白Marker（11-180KD）（赛默飞世尔，货号：# 26617），ECL Plus超敏发光液（兰杰柯，货号：BL520B），甲基CpG结合蛋白2（MecP2）（艾博抗，货号：ab253197）；三磷酸鸟苷酶活化蛋白（p250GAP）、CREB、BDNF（武汉三鹰，货号：15024-1-AP、122081-1-AP、28205-1-AP），GAPDH（优抗，货号：UM4002），羊抗兔IgG-HRP、羊抗小鼠gG-HRP（亲科生物，货号：S0001、S0002）。
1.4 主要仪器Morris水迷宫视频分析系统V2.0（安徽正华生物仪器设备有限公司）、Axopatch 700B型电容反馈膜片钳放大器（美国美谷分子仪器有限公司）、MP285型高精度显微操作器（美国萨特仪器公司）、P97型微电极拉制仪（美国萨特仪器公司）、BX50-WI型显微镜（日本奥林巴斯株式会社）、VT 1000 S型振动切片机（德国徕卡公司）、EMUC7型超薄切片机（上海徕卡仪器有限公司）、HT7800型透射电镜（日本日立公司）、高速低温组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）、PowerPac HC型电泳仪（美国伯乐生命医学产品有限公司）、M5型酶标仪（上海美谷分子仪器有限公司）、Trans-Blot SD型转膜仪（美国伯乐生命医学产品有限公司）、Tanon 5200型全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）。
2 方法 2.1 动物分组及给药应用Excel生成随机数字，把24只SAMP8小鼠随机分为两组，分别为模型组（简称SAMP8组）和YHD中药组（简称YHD组），每组12只。选择同月龄SAMR1小鼠12只作为对照组（简称SAMR1组）。
YHD组予中药复方颗粒剂灌胃，SAMP8组与SAMR1组则予同剂量的蒸馏水灌胃。小鼠给药剂量参照徐淑云《药理实验方法学》[12]中“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表”计算：人（70 kg）与小白鼠（20 g）之间系数为0.002 6，按患者每日YHD全方48 g生药计算，20 g小鼠为每日0.124 8 g生药，即生药6.24 g/kg，按照计算结果将中药复方颗粒剂用蒸馏水配成浓度0.624g/mL的药液，YHD组灌胃每日1次，每次灌胃0.2 mL，灌胃12周。SAMP8组与SAMR1组予0.2 mL的蒸馏水灌胃，每日1次，同样灌胃12周。
2.2 Morris水迷宫行为学检测在给药结束后，进行Morris水迷宫行为学检测，包括定位航行实验和空间探索实验，为避免视觉干扰，向水池中加入可食用黑色色素，让水池内的水成为不透明色。操作时将小鼠面向池壁放入Morris水迷宫水池，记录65 s内各组小鼠入水到游上平台所需用时，定位航行实验进行5 d。在第6天时进行空间探索实验，将水池中的平台移除后将小鼠面向池壁放入水池中，入水后开始计时，让小鼠自由探索65 s，记录小鼠65 s穿过原平台区域的次数及运动轨迹。
2.3 电镜观察神经元突触形态行为学检测后，每组随机选择3只小鼠，麻醉后快速剥取小鼠海马组织，固定过夜，脱水包埋，用包埋剂将小鼠海马挑入包埋模具中，放入烘箱，60 ℃ 24 h，用以聚合。在聚合完成后，进行修块、切片，每片厚度为70 nm。用2%醋酸双氧铀溶液染色20 min，2%柠酸铅溶液染色5 min。将准备完成的切片载网在电子显微镜120 kv中观察。
2.4 长时程增强实验（LTP）检测神经元突触功能行为学检测后，每组随机选择3只小鼠，麻醉后断头，迅速从颅腔取出大脑并游离海马组织。用震动切片机将海马组织横切，厚度400 μm，将脑片逐个移至记录槽中。细胞外记录电极位于CA1区的辐射层，场兴奋性突触后电位（fEPSP）由CA3区的同心圆电极激发。刺激参数选择200 μA，持续100 μs的单波。实验开始时测量刺激-反应曲线，以能引起最大反应幅度40%的刺激强度作为测试刺激强度。脑片以单测试脉冲刺激至少15 min，再以θ节律串刺激（TBS）诱导LTP，之后以单测试脉冲刺激60 min。TBS参数：X串刺激，串间隔为Xs；每串10个burst，间隔200 ms；每个burst包含4个100 Hz Pulse。实验测试Schaffer侧支通路的LTP。刺激电极距离记录电极200~400 μm。fEPSP的幅度变化与TBS刺激前10 min的fEPSP振幅（100%）相比较。
2.5 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组小鼠海马组织“CREB/BDNF信号通路”相关蛋白表达行为学检测后，每组随机选择3只小鼠，麻醉、断头并分离出海马组织。于冰上匀浆，裂解，超声粉碎；4 ℃，12 000 r/min，离心半径8.2 cm，离心10 min，取上清。BCA法进行蛋白定量。脱脂奶粉封闭后，按照抗体说明书（1∶1 000），加入6 μL的一抗，4 ℃摇床孵育过夜，TBST清洗3次，二抗（1∶3 000），室温摇床孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min。通过超敏ECL化学发光试剂盒，在发光成像系统中曝光成像并采集图片，使用ImageJ进行定量分析。
2.6 统计学方法使用SPSS 25.0分析处理数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，根据数据的性质与特点，重复测量数据使用广义估计方程（GEE），多组间比较选择单因素方差分析（one-way ANOVA），采用最小显著性差异法（LSD）或Dunnett T3进行两两比较；对于不符合正态分布的数据则使用Kruskal-Wallis法进行非参数检验，P < 0.05表示差异具有统计学意义。
3 结果 3.1 YHD干预对SAMP8小鼠行为学的影响各组第1天游泳平均速度无显著性差异。定位航行实验结果表明，SAMP8组及YHD组逃避潜伏期随时间波动变化，SAMR1组逃避潜伏期呈下降趋势。SAMR1组与SAMP8组比较逃避潜伏期显著减少（P < 0.01），与SAMP8组比较YHD组逃避潜伏期时间差异无统计学意义。因存在显著交互效应（P < 0.01），故行单独效应分析，结果显示，与SAMR1组比较，SAMP8组在第3、4、5天逃避潜伏期时间显著延长（P < 0.05，P < 0.01）；与SAMP8组比较，YHD组在第4、5天逃避潜伏期时间均显著缩短（P < 0.05，P < 0.01），见表 1。
| 组别 | 动物数 | 剂量(g/kg) | 首日平均游泳速度(x±s, mm/s) | 逃避潜伏期时间(x±s, s) | 穿越平台次数(次) | ||||
| 第1天 | 第2天 | 第3天 | 第4天 | 第5天 | |||||
| SAMR1组 | 12 | 0.00 | 12.17±3.07 | 56.25±9.56 | 51.25±10.71 | 46.16±18.39* | 43.58±19.62** | 40.19±19.29** | 0.5(2) |
| SAMP8组 | 12 | 0.00 | 10.25±3.65 | 58.25±9.25 | 58.16±10.11 | 58.61±10.90 | 60.60±6.69 | 62.15±7.85 | 0.0(1) |
| YHD组 | 12 | 6.24 | 11.25±4.03 | 55.17±12.09 | 53.72±11.33 | 57.14±8.10 | 45.40±16.77** | 42.39±20.58* | 1.0(3) |
| 注：与SAMR8组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。 | |||||||||
空间探索实验结果显示：各组小鼠空间探索过程中搜寻原平台方式如下：SAMR1组小鼠多在水池中心游泳搜寻，且多在目标象限（即原平台所在的第1象限）内进行寻找，目的性较强；SAMP8组小鼠则多沿水池边缘或随机方式进行搜寻，无明显特定象限的趋向性；YHD组小鼠多围绕水池中心搜寻，对目标象限有一定的趋向性。说明经过前5 d的定位航行实验学习训练后，SAMR1组小鼠对平台位置记忆牢固清晰，SAMP8组小鼠记忆较差，而YHD组小鼠记忆有所改善，见图 1。
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| 图 1 各组小鼠空间探索实验活动轨迹 |
穿越平台次数结果显示：与SAMR1组小鼠相比，SAMP8组穿越平台次数有所下降，与SAMP8组相比，YHD组穿越平台次数有所升高，但差异无统计学意义，见表 1。
3.2 YHD干预对SAMP8小鼠神经元突触结构的影响每组随机选择3只小鼠，使用透射电镜观察小鼠神经元，结果显示：SAMR1组整体神经元细胞膜完整，细胞形态清晰，核膜清楚，核仁明显，染色质分布均匀；胞细胞器质地清晰，粒体丰富，线粒体结构完整。内质网充足且颗粒均匀；突触前膜与后膜形态结构清楚连续，间隙明显，突触之间界限清晰，突触小体内富有大量神突触小泡，包膜连续完整，突触后膜内侧可致密物质分布均匀（图 2A1-A3）。SAMP8组神经元明显线粒体肿胀、双层膜结构欠完整，粗面内质网消失、核膜断裂，边界不清，核染色质分布不均，部分核碎裂、固缩，核核模糊；内质网核糖体脱落；突触数量有所减少，突触前后膜欠连续，突触间隙显著性增加，突触小泡减少，突触后膜内侧致密区减少，包膜异常，边界不清（图 2B1-B3）。YHD组神经元细胞核形部分链接断裂，核仁尚可，但是整体形态欠佳，染色质相对较均匀；部分线粒体出现轻度水肿，包膜不完整，粗面内质网轻度核糖体脱落；突触数量轻度减少，突触前膜和后膜比较清楚，部分膜出现断裂情况，轴突间隙较正常，突触小泡结构相对清晰，包膜完整度伤口但数量有减少，内侧致密区尚可（图 2C1-C3）。
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| 注：图A1-A3表示SAMR1组，图B1-B3表示SAMP8组，图表示图片标尺为C1-C3表示YHD组；1表示图片标尺为2 μm，2表示图片标尺为1 μm，3 500 nm；红色箭头指示突触。 图 2 各组小鼠神经元超微结构 |
每组随机选择3只小鼠观察海马突触神经电生理，结果显示：经TBS刺激后，各组小鼠LTP的fEPSP幅值均有所升高，组间比较结果显示：与SAMR1组相比，SAMP8组LTP的fEPSP幅值的提升幅度显著减少，差异具有统计学意义（P < 0.05）；与SAMP8组比较，YHD组LTP的fEPSP幅值的提升幅度明显升高，差异具有显著统计学意义（P < 0.05），见图 3。
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| 注：记录前15 min为基线，结束后给予TBS，16~75 min记录LTP，误差条为标准差。 图 3 各组小鼠海马LTP fEPSP标准化幅值随时间变化比较 |
经TBS刺激后，各组小鼠LTP的fEPSP斜率均有所升高。组间比较结果显示：与SAMR1组相比，SAMP8组LTP的fEPSP斜率的提升幅度显著减少，差异具有统计学意义（P < 0.05），与YHD组比较则没有统计学差异；与SAMP8组相比，YHD组LTP的fEPSP斜率的提升幅度明显升高，差异具有显著统计学意义（P < 0.05），见表 2。
| 组别 | 动物数 | fEPSP/基线 |
| SAMR1组 | 3 | 1.71±0.03* |
| SAMP8组 | 3 | 1.13±0.04 |
| YHD组 | 3 | 1.48±0.04* |
| 注：与SAMP8组比较，*P < 0.05。 | ||
每组随机选择3只小鼠观察海马CREB/BDNF通路关键蛋白的表达，结果显示：通过计算各组海马蛋白与内参蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的比值发现：与SAMR1组相比，SAMP8组小鼠海马内CREB、BDNF蛋白表达显著降低（P < 0.01），p250GAP蛋白表达有升高趋势，MecP2蛋白表达有降低趋势，无显著性差异；与SAMP8组相比，YHD组CREB蛋白表达显著增加（P < 0.01），BDNF及MecP2蛋白表达有升高趋势，p250GAP蛋白表达有降低趋势，无显著性差异，见表 3、图 4。
| 组别 | 动物数 | CREB/GAPDH | BDNF/GAPDH | P250GAP/GAPDH | MecP2/GAPDH |
| SAMR1组 | 3 | 0.42±0.01* | 0.32±0.02** | 0.23±0.02 | 0.32±0.02 |
| SAMP8组 | 3 | 0.26±0.03 | 0.23±0.01 | 0.25±0.01 | 0.30±0.01 |
| YHD组 | 3 | 0.34±0.01** | 0.26±0.01 | 0.24±0.03 | 0.33±0.03 |
| 注：与SAMP8组比较，*P < 0.05；与SAMP8组比较，**P < 0.01。 | |||||
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| 图 4 各组小鼠大脑“CREB/BDNF信号通路”相关蛋白表达电泳 |
AD属于中医“痴呆”“呆病”等病症范畴，中医认为AD的发病与肾虚密切相关。年老体衰，肾精不足，脑髓生化乏源导致脑窍失养，神机失用，故而发为本病[13]。肾虚髓亏是AD的致病之本，而肾脏虚衰累及诸脏，导致痰瘀内生互结，痹阻脑络，更导致肾精气血难以濡养于脑，形成恶性循环，以至病情渐进加重。针对于此，著名中医脑病专家张伯礼院士提出益肾化浊法兼以补益肾精和蠲除浊邪切中要机[14]。在此思想的指导下，结合本院脑病针灸中心近十年临床实践经验和诸多专家建议进一步优化总结出了YHD以治疗AD患者，疗效显著并被广泛认可。该方通过女贞子、何首乌以益精填髓，淫羊藿、肉苁蓉以补肾助阳，四味药合用阴阳相济以补肾；配合石菖蒲豁痰开窍、川芎活血行气以达蠲除浊邪之效。近些年来，本课题组对益肾化浊法防治AD进行了较为系统的研究，通过多项体内体外实验发现，YHD可通过对突触功能的调节，唤醒沉默突触，可改善SAMP8小鼠的神经元和突触的微观结构[15]，同时发现益肾化浊法中药复方及部分单体可增加不同月龄SAMP8痴呆模型小鼠大脑皮质区和海马区记忆相关蛋白CREB的表达，其中对海马区CREB蛋白的调节作用更明显，但对其分子生物学机制未作深入探讨。
SAMP8小鼠是一种早期学习记忆障碍模型，其学习记忆障碍较早出现且伴随年龄增长而自然发生，随着月龄增长其学习记忆障碍逐渐加重，较好的模拟了人类AD的认知下降过程，因此常作为用于研究AD的动物模型[16]。SAMR1小鼠则具有正常小鼠的衰老进程，因此常作为SAMP8小鼠的空白对照组[17]。在既往的研究中，发现4月龄起SAMP8小鼠逐渐出现学习记忆功能的障碍，并随着月龄增长逐渐加重[18]，因此本研究最终选择了3月龄的SAMP8小鼠进行早期干预，观察YHD是否能通过调节“CREB/BDNF信号通路”，进而保护突触可塑性，延缓SAMP8小鼠学习记忆减退的发生，以达到早期防治AD的作用。
Morris水迷宫是常用的行为学检测手段，多用于评估AD动物模型的学习记忆能力，逃避潜伏期体现了实验动物的空间学习能力，穿越平台次数体现了实验动物的短期记忆能力。学习和记忆等认知过程依赖于某些关键脑区（海马组织、纹状体、皮质）突触传递效能的变化，尤其长时程增强（LTP）与学习、记忆存在密切联系[19]，LTP可以增强神经元之间的联系，突触功能障碍常表现出LTP的损害，代表着神经元间信息传递的灵活性和稳定性受损，最终表现出学习记忆功能降低和认知行为异常等[20]。本研究结果发现，灌胃12周后，YHD可有效改善SAMP8小鼠的空间学习能力及短期记忆能力，减轻海马区神经元突触的超微结构损伤，提高LTP的fEPSP斜率，从而验证了YHD提高SAMP8小鼠学习记忆能力与其改善了海马突触结构及功能密切相关。
突触可塑性是指神经元突触在形态和功能上的动态调节能力，表现为突触传递效能的持久性增强或减弱，这一现象被认为是神经系统适应环境变化、实现学习与记忆的核心机制[21]。AD病变早期的认知障碍在很大程度上是由Aβ寡聚体积累引起的突触功能障碍[22]。AD患者脑内突触可塑性的受神经递质、相关蛋白及多个信号通路共同调节，其中“CREB/BDNF信号通路”在突触形成及学习记忆改善等方面发挥着重要调节作用[23]。CREB作为一种转录增强因子，主要调节突触可塑性相关蛋白的合成，是突触强化和记忆形成过程中多条激活通路的中心汇聚点[24]，CREB是BDNF的关键转录因子，在磷酸化后，CREB与BDNF外显子Ⅳ启动子结合，能直接激活BDNF转录[25]。同时，它又能正向抑制下游p250GAP蛋白合成，反向提高上游MecP2蛋白的表达，进而影响突触可塑性及学习记忆，在通路里具有承上启下的作用[26]。MecP2在大脑突触发育及神经元成熟之中起到重要的调节作用，与学习记忆功能及突触可塑性密切相关[27]，激活MeCP的可以减轻BDNF启动子Ⅳ的转录抑制功能，进而促进BDNF的转录[28]。p250GAP是一种GTP酶作用蛋白，是microRNA-132（miR-132）的结合蛋白，miR-132由CREB高度诱导，通过降低p250GAP的水平来增强神经元形态发生和神经突生长[29]，抑制p250GAP蛋白的表达被证明有促进轴突生长的作用[30]。BDNF是一种主要在大脑内合成的内在神经营养因子，在海马体和大脑皮层中显著表达[31]，直接参与海马神经元的发生，维持神经细胞的生长与发育，是学习和记忆形成的基础，对LTP有重要的促进作用[32]。它一方面受CREB的调控，又能反过来通过上调丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2来提高CREB的表达[33]，BDNF同样可以促进MeCP2的激活[34]，并可以通过促进miRNA132进而抑制p250GAP蛋白水平[35]。由此可见CREB、BDNF既可以作为调控突触可塑性的关键因子，又能与多种靶基因或相关蛋白相互作用形成信号网络，调节突触形态变化和可塑性过程[36]，进而发挥对突触可塑性的保护作用，并广泛参与神经系统的再生修复、学习记忆以及意识情绪等过程。研究发现，SAMP8小鼠脑内CREB和BDNF蛋白含量出现了显著降低（P < 0.01）；而采用YHD干预后，CREB蛋白含量得到明显提升（P < 0.01），MecP2及BDNF出现了升高的趋势，同时p250GAP出现了下降趋势，由此验证了YHD改善神经元突触可塑性与调控CREB/BDNF通路相关，同时部分揭示了益肾化浊方“补益肾精，蠲除浊邪”的分子生物学基础，为该方临床应用于AD早期干预提供了坚实的实验依据。研究中，p250GAP与MecP2的表达无显著差异，可能因其不直接位于“CREB/BDNF信号通路”的下游，故而表达水平相对稳定。未来，团队计划进一步通过体外实验明确p250GAP与MecP2在“CREB/BDNF通路”中的作用，更全面深入地探讨YHD延缓SAMP8小鼠学习记忆减退及治疗AD的作用机制。
综上所述，YHD早期干预可能通过调节“CREB/BDNF信号通路”，降低p250GAP蛋白的表达，上调大脑海马区记忆关键蛋白CREB、MecP2及BDNF蛋白的表达，从而保护神经元突触可塑性，延缓SAMP8小鼠学习记忆减退的发生，以达到早期防治AD的作用。
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