清音饮为天津中医药大学第一附属医院中药制剂，始载于《天津市医疗机构制剂规范》（1998年版）。该制剂由炒决明子、金银花、麦冬等5味中药组成，具有清热凉血、生津润燥之功效，主要用于缓解津液不足所致的口干咽燥，以及嗓音嘶哑、慢性咽炎、咽喉肿痛等症状。经多年临床应用观察疗效确切 ^[1-2]，且未见明显不良反应报道。张慧琪等 ^[2]研究发现，清音饮可以通过上调咽部黏膜免疫保护分子分泌型免疫球蛋白A（sIgA）、人β防御素2（HBD-2）及人β防御素3（HBD-3）的表达水平，从而发挥防治慢性咽炎的作用，该结论为其临床应用提供了实验依据。

现阶段，清音饮主要依靠理化方法与薄层色谱（TLC）进行鉴别。已有文献 ^[3]对单一成分的含量测定进行了报道，但尚未建立基于多指标成分同步定量的系统分析方法，难以全面反映其整体质量属性。

本研究基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术，建立了清音饮中绿原酸、木犀草苷、橙黄决明素、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸及4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸5种有效成分的同步定量分析方法。该方法旨在完善清音饮的质量控制体系，并为相关复方制剂的质量评价提供参考。

1 材料 1.1 仪器

超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪，Waters公司；冷冻高速离心机（离心半径为73 mm），Thermo公司；十万分之一微量天平，赛多利斯实验室仪器有限公司；超声波清洗仪，深圳市洁盟清洗设备有限公司；高速粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司。

1.2 试药

对照品：橙黄决明素（批号：111900-202006）、绿原酸（批号：110753-202119）、木犀草苷（批号：111720-202312）、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸（批号：111782-202309）和4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸（批号：111894-202205），均购自中国食品药品检定研究院。按照证书所示，所有化合物纯度分别不低于99.0%、96.3%、98.1%、95.0%与94.9%；饮片：炒决明子、金银花、麦冬、胖大海、青果均购自天津饮片厂。试剂：甲醇、乙腈（色谱纯，Merck公司）；甲酸（色谱纯，Fisher公司）；超纯水为实验室自制。

2 方法与结果 2.1 溶液制备 2.1.1 标准溶液配制

用于实验的橙皮决明素、绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸标准溶液，其配制过程为：各对照品经准确称量后，加入甲醇配制成质量浓度分别为0.2、0.5、0.2、0.5、0.5 μg/mL的混合对照品溶液。将上述溶液用甲醇依次稀释2、2、2、2、2、2.5、2、2倍，得到9个系列质量浓度的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备

称取处方量药材共计200 g，加10倍量水煎煮回流提取2次，每次1 h，滤过，合并两次滤液，得到清音饮提取液。精密量取该提取液适量，依据“2.2”项色谱条件测定不同成分，分别稀释制备：1）用于测定橙皮决明素、木犀草苷及4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的供试品溶液。精密量取提取液适量，以50%甲醇溶液定量稀释400倍，摇匀。2）用于测定绿原酸和3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的供试品溶液。精密量取提取液适量，以50% 甲醇溶液定量稀释4 000倍，摇匀。

将上述两种稀释后的溶液13 000 r/min离心10 min（离心半径73 mm），取上清液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 UPLC-MS/MS分析条件 2.2.1 色谱条件

采用Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以0.1% 甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱，程序见表 1。实验流速为0.3 mL/min，柱温箱设置为35 ℃，进样量为5 μL。

2.2.2 质谱条件质谱检测在电喷雾电离源的负

离子模式下进行，数据采集选用多反应监测方式，毛细管电压设置为2.5 kV，锥孔气流速40 L/h，脱溶剂气流量900 L/h，脱溶剂气温度500 ℃，离子源温度150 ℃，其他参数见表 2。

2.3 方法学考察 2.3.1 专属性考察

为获取多反应监测色谱图，将空白、对照品与供试品溶液按照“2.2”项方法进样分析，相关色谱图见图 1。

2.3.2 线性关系

经系列混合对照品溶液（共9个浓度水平）进行考察，所有样品均按照“2.1”项方法分析。标准曲线的绘制以质量浓度为自变量（X），峰面积为因变量（Y），并据此计算回归方程、线性范围、相关系数及最低定量限。见表 3。

2.3.3 精密度实验

通过同一对照品溶液的重复测定进行评估。依据“2.2”项色谱条件，分别进行日内（1 d内平行测定6次）与日间（连续3 d测定）精密度实验，并计算各成分峰面积的相对标准偏差。结果显示，橙黄决明素、绿原酸、木犀草苷及两种二咖啡酰基奎宁酸的日内相对标准偏差（RSD）依次为1.63%、3.09%、1.20%、4.18%、2.26%；日间RSD值分别为2.30%、2.70%、3.27%、4.48%、3.34%。结果表明，该方法具有良好的精密度。

2.3.4 重复性实验

为评估方法的重复性，取同一份清音饮提取液，独立制备6份供试品溶液，并按照“2.1”项色谱条件进行分析。测定上述5种成分的含量，并计算其RSD。结果显示，橙黄决明素、绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的RSD值依次为1.49%、1.88%、4.18%、3.01%、3.53%，表明本方法的重复性符合要求。

2.3.5 溶液稳定性考察

取同一供试品溶液，于室温条件下分别放置0、2、4、8、12、24 h后，依照“2.2”项方法进样分析，考察样品稳定性。通过计算各时间点5种成分色谱峰面积的RSD，得到橙黄决明素、绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的RSD依次为1.1%、1.9%、2.6%、1.5%、2.4%。以上结果说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率实验

为考察方法的准确性，进行加样回收率实验。精密称取已知含量的清音饮提取液供试品9份，分别按照供试品中各待测成分含量的50%、100%、200%水平精密加入相应对照品溶液，按照“2.1.2”项方法操作，制备供试品，每个浓度平行制备3份，依照“2.2”项方法进样测定，计算橙黄决明素、绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸5种成分的平均回收率及RSD值。上述5种成分在低（50%）、中（100%）、高（200%）3个加样水平下的平均回收率分别为94.00%~107.56%、97.80%~112.32%、104.13%~112.11%，相应RSD（n=3）分别为4.68%~8.61%、3.23%~7.78%、1.04%~7.98%。结果表明方法准确度良好。

2.4 样品含量测定

精密称取6个批号的清音饮样品，按照“2.1.2”项规定程序，完成供试品的制备，参照“2.2”项既定色谱条件完成测定，计算含量，见表 4。

3 讨论

本研究基于清音饮的组方原则（君药决明子，臣药金银花、麦冬），结合《中华人民共和国药典》（2020年版）相关药材的质控要求，并充分考虑制剂工艺与功效的相关性，对质量评价指标进行了系统筛选。君药决明子中，《中华人民共和国药典》指标成分大黄酚在经水提取过程中转移率低、热稳定性较差，与文献报道相符 ^[4-5]，故不适宜作为本制剂的核心质量控制指标。橙黄决明素为决明子中的重要活性成分，具有抗炎、保护肝脏等作用 ^[6-7]，与方剂清热解毒功效密切相关。本研究证实其在制剂中含量稳定、转移良好，可以作为决明子的质量标志物。臣药金银花中的绿原酸与木犀草苷为《中华人民共和国药典》收录指标，具有抗菌、抗病毒活性 ^[8]，与清音饮功效一致。此外，金银花所含的3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸与4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸亦具有抗炎、抗氧化等作用 ^[9-11]。本研究中上述成分检测结果稳定、含量较高，能够较好反映该药味质量。另一臣药麦冬的指标成分鲁斯可皂苷元，在本研究建立的UPLC-MS/MS方法中响应较弱，未能达到稳定定量要求，与文献中关于其经水提取转移率低、质谱响应不高的报道 ^[12-15]一致，因此未纳入本次质量控制体系。本研究选择橙黄决明素、绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸及4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸共5种功效关联成分作为质量评价指标，并建立UPLC-MS/MS分析方法，实现多成分同步、准确测定，为清音饮的质量控制提供了可靠依据。

为获得目标成分的最佳分离条件与质谱响应，本研究对色谱、质谱条件进行了系统优化。在色谱条件优化中，重点考察了不同流动相体系（包括水-乙腈、水-甲醇，以及含0.05%~0.2%甲酸的水溶液-甲醇/乙腈系统）对5种成分分离效果的影响。综合评价峰形对称性（要求对称因子0.8~1.2）、分析时间及质谱响应强度等指标，最终确定以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）作为流动相系统。在该条件下，各分析物峰形对称性良好，分离度符合色谱分离要求，且分析时间较短。在此基础上，通过优化梯度洗脱程序，确立了最终的色谱条件。在质谱条件优化中，主要针对离子源参数进行调节，以提升检测灵敏度。结果表明，在负离子模式下，经优化的质谱参数可以显著增强目标化合物的离子化效率，保证其具有高强度的质谱响应和良好的方法选择性。该方法重现性良好（RSD < 5%），符合定量分析要求，能够满足清音饮复杂基质中多成分的同步准确定量分析。

鉴于各目标成分在极性及溶解性上存在差异，为实现高效提取，本研究对供试品溶液的制备方法进行了系统优化。实验以提取回收率与色谱峰纯度为评价指标，重点比较了水、甲醇、乙醇及其不同体积分数水溶液的提取能力。综合比较研究结果，表明采用50%甲醇水溶液作为提取溶剂时，所有待测成分均能实现高效提取，且色谱图中共存杂质的干扰较小。该方法简便、高效，所得提取液经0.22 μm微孔滤膜过滤后即可直接进行UPLC-MS/MS分析。

此外，本研究在方法学验证基础上，进一步对5种指标成分的质量评价意义及测定结果的批次一致性进行了综合分析。从含量测定结果（表 4）可见，6批清音饮样品中绿原酸含量最高（平均1 299.12 μg/mL），其次为4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸（平均230.88 μg/mL）与3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸（平均137.93 μg/mL），橙黄决明素（平均76.31 μg/mL）与木犀草苷（平均36.31 μg/mL）含量相对较低。该含量分布规律与各味中药在复方中的处方比例及该类成分的水提取转移特性基本吻合：金银花作为臣药且用量较大，其所含的绿原酸及二咖啡酰基奎宁酸类成分极性适中、水溶性较好，在水提过程中易于溶出，因而在制剂中呈现较高含量；决明子中的橙黄决明素为蒽醌类苷元，水溶性相对较低，但其在复方煎煮过程中仍然能够保持稳定的转移率，且与本研究中精密度、重复性结果共同表明该成分可以作为决明子的稳定质量控制指标。从批次间的一致性来看，6批样品中5种成分含量的RSD范围为2.44%~4.76%，均小于5%，提示该制剂的制备工艺稳定性良好，所建立的多指标测定方法能够有效反映批次间的质量差异。

综合上述分析，本研究筛选的5种功效关联成分不仅从药效学角度与清音饮“清热凉血、生津润燥”功能主治高度契合，且在方法学上展现了良好的可测性与稳定性，能够较为全面地反映制剂质量。相较于已有文献报道的单一成分含量测定方法 ^[3]，本研究所建立的多指标UPLC-MS/MS同步定量策略显著提升了质量控制的覆盖面和专属性，为后续清音饮的药效物质基础研究及质量标准提升提供了更为充分的分析依据。

4 结论

本研究成功建立了一种基于UPLC-MS/MS技术同时测定清音饮中橙黄决明素、绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸及4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸5种有效成分的分析方法。经验证，该方法灵敏度高、专属性强、重复性好，各项方法学指标均符合定量分析要求。本方法的建立克服了原有质量控制方法单一、难以整体评价药品质量的不足，可以为清音饮质量标准的修订与提升提供科学依据，并为其临床疗效的关联性研究奠定基础。