枳实薤白桂枝汤记载于《金匮要略》一书中《胸痹心痛短气病脉证治第九》^[1]，由枳实、薤白、桂枝、厚朴、瓜蒌5味中药组成^[2]。在中医理论中主要用于治疗胸痹，在现代临床研究发现，枳实薤白桂枝汤对各心脏类疾病具有良好的疗效，例如冠心病、心肌梗死、心绞痛等疾病^[3-6]。其主要化学成分有挥发油类、有机酸类、鞣质类、香豆素等^[7]。

由于枳实薤白桂枝汤中组分及化学成分复杂，而其含量测定也多为高效液相色谱法（HPLC）^[8-9]，文献报道的枳实薤白桂枝汤含量测定主要是测定槲皮素、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷和厚朴酚等^[10-12]成分，存在测定成分较少、检测限较高、检测时间长等问题，对枳实薤白桂枝汤质量控制的标准尚不完整，但随着枳实薤白桂枝汤在临床上的广泛应用，质量控制尤为必要。因此，本研究建立了专属、灵敏、快速的超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS/MS）法，并用外标法^[13-14]测定枳实薤白桂枝汤中各组分的主要的代表成分槲皮素^[15]、芹菜素^[16]、原儿茶酸^[17]、木犀草素^[16]、紫丁香苷、阿魏酸、柚皮苷^[18]、厚朴酚^[19]、橙皮苷^[20]、新橙皮苷^[18]的含量，为枳实薤白桂枝汤质量标准的制定提供参考。

1 仪器与试剂

QTRAP 4500高分辨液质联用仪（美国AB Sciex公司）；MS205DU分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；LEAGENO MICRO21 R低温高速离心机（美国Thermo公司）；Concentrator plus真空浓缩仪（德国Eppendorf公司）；KQ5200超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

枳实薤白桂枝汤颗粒购自天津中医药大学附属保康医院（批号20210212、20210316、20210511）。槲皮素（批号19082203）、芹菜素（批号：20042801）、原儿茶酸（批号：20052804）、木犀草素（批号：20121605）、紫丁香苷（批号：18080602）、阿魏酸（批号：18022403）、柚皮苷（批号：20121802）、厚朴酚（批号：20040301）、橙皮苷（批号：2011030）、新橙皮苷（批号：18062902）均购自成都普菲德生物技术有限公司（纯度均≥98%）。色谱纯甲醇和乙腈购自于德国默克公司。纯净水为屈臣氏纯净水购自于广州屈臣氏食品饮料有限公司。色谱纯甲酸购自上海阿拉丁生化技术公司。

2 方法和结果 2.1 分析条件 2.1.1 色谱条件

Welchultimate XB-C₁₈色谱柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相为0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱，洗脱梯度（0~2 min，20% B；2~3 min，20%~40% B；3~6 min，24%~46% B；6~8 min，46%~80% B；8~12 min，80% B；12~12.1 min，80%~20% B；12.1~15 min，20% B）。柱温40 ℃，流速0.2 mL/min，进样量3 μL。

2.1.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），多反应检测（MRM）；紫丁香苷为正离子扫描模式。电喷雾电压为4 500 V，槲皮素、芹菜素、原儿茶酸、木犀草素、阿魏酸、柚皮苷、厚朴酚、橙皮苷、新橙皮苷为负离子扫描模式，电喷雾电压为-4 500 V；离子源气体1（GS1）为40 psi；离子源气体2（GS2）为50 psi；离子源温度500 ℃；碰撞气：Low；主要质谱参数见表 1。

2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液制备

精密称取槲皮素、芹菜素、原儿茶酸、木犀草素、紫丁香苷、阿魏酸、柚皮苷、厚朴酚、橙皮苷、新橙皮苷，分别置于1 mL容量瓶中，加甲醇定容至1 mL，分别配成4.98、5.04、4.90、4.95、5.05、4.97、5.06、4.94、5.02、4.96 mg/mL母液。置于4 ℃冰箱中保存备用。

2.2.2 供试品溶液制备

称取0.1 g枳实薤白桂枝汤颗粒，置于25 mL锥形瓶中，加70%甲醇定容至刻度线，精密称质量，超声30 min至溶解，再精密称定，用溶剂补足减失的质量，过0.22 μm滤膜，滤液储存于-4 ℃冰箱，备用。

2.3 方法学验证 2.3.1 专属性考察

对照品溶液（A）、枳实薤白桂枝汤样品（B）及甲醇空白溶液（C）的色谱图见图 1。由图 1可知，枳实薤白桂枝汤中10种成分分离度好，专属性良好。

2.3.2 线性关系、检测限及定量下限

取“2.2.1”中各对照品母液，将各成分对照品母液用甲醇依次稀释为7个不同浓度的对照品溶液混匀，配置成槲皮素的浓度为分别1.992、3.984、5.976、9.96、14.94、29.88、49.8 ng/mL；芹菜素的浓度为0.202、0.504、1.008、2.016、4.032、6.048、10.08 ng/mL；木犀草素的浓度为0.198、0.495、0.99、1.98、3.96、5.94、9.9 ng/mL；原儿茶酸的浓度为1.96、9.8、19.6、49、98、196、490 ng/mL；紫丁香苷的浓度为2.02、10.1、20.2、50.5、101、202、505 ng/mL；阿魏酸的浓度为1.988、9.94、19.88、49.7、99.4、198.8、497 ng/mL；柚皮苷浓度为2.024、10.12、20.24、50.6、101.2、202.4、506 ng/mL；厚朴酚浓度为4.94、9.88、49.4、98.8、494、988、1 976 ng/mL；橙皮苷的浓度为10.04、20.08、50.2、100.4、200.8、502、1 004 ng/mL和新橙皮苷浓度为9.92、19.84、49.6、99.2、198.4、496、992 ng/mL。按“2.1”色谱条件下进样分析。其中以对照品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程。以信噪比为10∶1为定量下限（LLOQ）。10种化合物的线性回归方程及各成分LLOQ见表 2。10种成分的相关系数r均大于0.995，表明10种成分在相应的范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度实验

取对照品溶液，按“2.1”分析条件下连续进样6次，测得枳实薤白桂枝汤中10种成分槲皮素、芹菜素、原儿茶酸、木犀草素、紫丁香苷、阿魏酸、柚皮苷、厚朴酚、橙皮苷、新橙皮苷的RSD分别为1.49%、2.16%、2.86%、1.85%、1.42%、1.12%、2.36%、1.16%、1.61%、2.64%。表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性实验

取同一枳实薤白桂枝汤供试品溶液（批号20210212），在“2.1”分析条件下，分别在0、6、24 h进样测定，测得枳实薤白桂枝汤中10种成分槲皮素、芹菜素、原儿茶酸、木犀草素、紫丁香苷、阿魏酸、柚皮苷、厚朴酚、橙皮苷、新橙皮苷的RSD分别为0.66%、0.87%、0.33%、1.14%、0.57%、0.23%、0.18%、2.04%、0.83%、0.98%。表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性实验

取同一枳实薤白桂枝汤颗粒（批号20210212），按“2.2.2供试品溶液制备”项下平行制备供试品溶液6份，在“2.1”分析条件下进行分析，测得枳实薤白桂枝汤中10种成分槲皮素、芹菜素、原儿茶酸、木犀草素、紫丁香苷、阿魏酸、柚皮苷、厚朴酚、橙皮苷、新橙皮苷的RSD分别为1.56%、0.81%、1.75%、0.46%、2.28%、2.61%、2.29%、0.83%、2.86%、1.51%。表明该方法重复性良好。

2.3.6 加标回收率实验

精密称取本品0.05 g（批号20210212），加入对照品溶液（各成分理论含量与0.1 g本品相同），按“2.2.2”项下方法平行制备6份。在“2.1”分析条件下进行分析，计算各成分加样回收率和相对标准偏差（RSD）值。测得枳实薤白桂枝汤中10种成分槲皮素、芹菜素、原儿茶酸、木犀草素、紫丁香苷、阿魏酸、柚皮苷、厚朴酚、橙皮苷、新橙皮苷的加样回收率分别为100.69%、99.72%、98.41%、98.78%、100.85%、97.68%、100.12%、99.86%、98.76%、101.66%；RSD值分别为1.83%、2.94%、1.83%、1.77%、2.37%、1.39%、2.28%、1.96%、2.56%、2.98%。

2.4 样品含量测定

取“2.2.2”步骤中供试品溶液，用甲醇稀释10倍，取100 μL稀释供试品挥干，加100 μL，50%乙腈复溶，涡旋3 min，14 000 r（离心半径为8.6 cm）离心10 min，取上清液80 μL，在“2.1”色谱条件下进行分析。含量测定结果见表 3。

3 讨论 3.1 流动相的选择

为了获得最佳的色谱性能和更短的保留时间，先后对水-乙腈以及0.1%甲酸水-乙腈系统进行了测试。测试结果表明采用甲醇-水水-乙腈体系时，枳实薤白桂枝汤胃力康颗粒中各个成分分离度较差，加入甲酸后各色谱峰分离度明显改善，且甲醇-0.1%甲酸水-乙腈体系洗脱时分离效果最好，0.1%甲酸水-乙腈系统洗脱时色谱效果最佳，因此选择其作为流动相。10个分析物的洗脱时间为15 min，未观察到干扰峰。

3.2 质谱条件的优化

槲皮素、芹菜素、紫丁香苷、阿魏酸、厚朴酚、橙皮苷、在正负离子模式下均有响应，其中紫丁香苷在正离子模式下响应更好，检测限更低，槲皮素、芹菜素、紫丁香苷、阿魏酸、厚朴酚、橙皮苷均在负离子模式下响应更高，而原儿茶酸、木犀草素、柚皮苷、新橙皮苷只在负离子模式下有响应，经离子挑选后，选择了各成分响应最高的离子模式，大大调高了方法的适用范围。

3.3 结果分析

本研究结果表明在3种批次枳实薤白桂枝汤中槲皮素、芹菜素、原儿茶酸、木犀草素、紫丁香苷、阿魏酸、柚皮苷、厚朴酚、橙皮苷以及新橙皮苷的相对标准偏差分别为3.11%、6.25%、3.67%、1.61%、24.95%、12.61%、7.55%、5.89%、4.04%和8.86%。表明在不同批次的枳实薤白桂枝汤中，槲皮素、芹菜素、原儿茶酸、木犀草素、柚皮苷、厚朴酚、橙皮苷以及新橙皮苷在不同批次间的差异较小；紫丁香苷和阿魏酸的含量存在较大差异，尤其是紫丁香苷的差异较大。因此为保证临床用药药效的专一性，有必要进一步加强枳实薤白桂枝汤的质量控制。枳实薤白桂枝汤中含有多种不同种类成分，如槲皮素、芹菜素、木犀草素、柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷为黄酮类化合物^[21-25]；原儿茶酸和阿魏酸为酚酸类化合物^[26-27]；紫丁香苷是苯丙素类化合物^[28]；厚朴酚是木脂素类化合物^[29]。这些单体成分对各类心血管疾病均具有良好的药效。其中紫丁香苷和厚朴酚在枳实薤白桂枝汤中含量最高，并具有防治心肌缺血^[30]和保护心脏缺血再灌注损伤、减少动脉粥样硬化变化的作用^[31-32]，其次含量较高的橙皮苷具有心血管保护的作用^[33]，阿魏酸具有降低心肌缺血和耗氧量的作用^[34]，柚皮苷也具有治疗心肌缺血再灌注损伤的作用^[35]。枳实薤白桂枝汤以薤白和瓜蒌共为君药，其中薤白性温，可通阳散结，而瓜蒌性寒，可宽胸散结，两者均可治疗胸痹心痛。枳实和厚朴共为臣药，可共助君药宽胸散结、下气除满、通阳化痰之效。桂枝作为佐药，可通阳散寒，降逆平冲与薤白相配伍可以加强其宣通上焦的功效，又可以下达中、下二焦，温化阴气。以上5味药材相配伍合用，可以振阳气，消阴寒，使体内气机顺畅，治疗疾病^[36]。因此，对枳实薤白桂枝汤颗粒中各成分的含量进行测量，为其质量控制提供参考，保证其临床疗效十分重要。

本实验建立UHPLC-MS/MS法测量枳实薤白桂枝汤中槲皮素、槲皮素、芹菜素、原儿茶酸、木犀草素、紫丁香苷、阿魏酸、柚皮苷、厚朴酚、橙皮苷以及新橙皮苷的含量。该方法快速，简单，灵敏，准确，可为评价该药品质量标准的建立提供参考。