2023, Vol. 42文章信息
- 杨晓华, 刘二伟, 马亚宣, 吴垚锌, 苗琳
- YANG Xiaohua, LIU Erwei, MA Yaxuan, WU Yaoxin, MIAO Lin
- 基于实验和网络药理学探讨丹知青娥方改善下尿路症状的作用和分子机制
- Study on the effect and mechanism of Danzhi Qing'e Formula in improving lower urinary tract symptoms based on experiment and network pharmacology
- 天津中医药大学学报, 2023, 42(3): 322-333
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2023, 42(3): 322-333
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2023.03.10
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文章历史
收稿日期: 2023-03-01
2. 天津中医药大学组分中药国家重点实验室，天津 301617;
3. 天津中医药大学方剂学教育部重点实验室，天津 301617
2. State Key Laboratory of Component Chinese Medicine of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China;
3. Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medical Formula of Ministry of Education of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China
下尿路症状（LUTS）是尿频、尿急、尿流变细、尿等待、尿滴沥以及排尿困难等一系列泌尿系统症状的总称，它不仅影响患者的生活质量，严重时还可诱发尿潴留、肾积水、肾功能损害等，危及患者生命安全[1]。统计学研究显示，男性LUTS的发病率与年龄增长密切相关[2]。随着中国社会老龄化进程加剧，受LUTS影响的人群数量亦将呈现急剧增加趋势。
研究发现，多种泌尿系统疾病，如良性前列腺增生症（BPH）、神经源性膀胱（NB）和膀胱过度活动症（OAB）等均可导致男性LUTS的发生[3-6]。治疗上，主要依据病因和临床症状的差异而选择不同药物。例如，针对BPH导致的LUTS多采用5α-还原酶抑制剂（如度他雄胺、非那雄胺）联合α1受体拮抗剂（如坦索罗辛、多沙唑嗪）的方式抑制雄激素信号通路，调控逼尿肌异常收缩；针对NB、OAB患者多采用M受体阻滞剂（如达非那新、曲思氯胺）[7-8]抑制逼尿肌过度活动；针对逼尿肌舒缩无力症状尚无有效药物，治疗首选间歇导尿法。LUTS的症状复杂，在患病初期主要表现为膀胱壁及逼尿肌肌层增厚、逼尿肌收缩增强的代偿性反应。若治疗不及时，还可由于长期收缩过度而使逼尿肌功能受损，表现出纤维化、收缩力下降等失代偿现象[9-10]。另外，上述药物长期服用还存在一定毒副作用。有报道发现，5α-还原酶抑制剂可能导致非酒精性脂肪肝疾病、胰岛素抵抗、2型糖尿病、干眼症、肾功能障碍及其他代谢功能障碍[11]，α1受体阻滞剂可能引起患者头晕、无力、直立性低血压病和射精异常等不良事件[12]。因此，寻找安全、有效的LUTS治疗药物意义重大。
中医认为LUTS属“癃闭”“淋证”范畴，病位在膀胱。《素问·五常政大论》道“其病癃闭，邪伤肾也”。《诸病源候论》云“诸淋者，由肾虚而膀胱热故也”。从肾着手，调理膀胱功能，攻治水道不利是中医治疗LUTS的主要法则。
“青娥方”出自《太平惠民和剂局方》，为温补肾阳的常用方，多以肾虚腰痛、起坐不利、腰膝酸软、小便不利或反多等为辨证要点，临床上主要用于肾阳虚衰疾病的治疗。丹知青娥方（DZQE）在原方补骨脂（Psoraleacorylifolia Linn.）和杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）温补肾阳的基础上，加以丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）和知母（Anemarrhenaasphodeloides Bunge）拟定化裁而成。方中补骨脂性温，《神农本草经疏》称其“禀火土之气，而兼得乎天令之阳”，《本草求真》中用治“火衰肾泄不固”，补肾助阳；杜仲性平、温，益肾填精，强筋骨；两药合用，陈士铎赞曰“盖补骨脂温补命门之火，杜仲滋益肾中之水，兼水火既济之美，增补肾阳”。丹参性微寒，活血祛瘀，血行则水利。知母性寒，沉而降，以泻肾中浮游之火，久用以补肾中之水，亦能促命。此两味药物的加入，使补阳药得通、得活、得清，则温而不燥，缓缓予之，相得益彰。诸药合用，全方补阳调阴，共守平衡，具补肾阳以行水之功。临床研究显示，DZQE对绝经期妇女的血管舒缩失调症疗效甚佳[13]。现代研究发现，方中4味药物均具有雌激素样作用[14-17]，可分别在抗肿瘤[18-21]、抗氧化[22-23]、抗菌、抗炎、促进骨生长[24-25]、提高免疫力、抗动脉粥样硬化[26-28]、改善记忆力[29]等方面发挥作用[30-34]。在调节膀胱功能方面，研究发现DZQE中单味药丹参及杜仲的活性成分具有利尿作用。董晓静等[35]报道指出，丹参可以通过调节肾组织水通道蛋白2（AQP2）而发挥活血利尿功效。杜仲的活性成分桃叶珊瑚苷可以促进正常大鼠、小鼠排尿[36-37]。然而，DZQE是否可用于男性LUTS尚不清楚。
本研究通过体外逼尿肌肌条张力实验和排尿参数检测实验，明确DZQE具有调节雄鼠膀胱功能的作用，进一步用网络药理学方法预测其对于LUTS的可能作用机制，为DZQE用于治疗男性LUTS提供数据支持。
1 材料 1.1 动物Wistar大鼠，雄性，体质量（250±30）g，购于北京维通利华实验动物有限公司。许可证号：SCXK（京）2016-0006。
1.2 药物补骨脂（批号：820180606）、杜仲（批号：180701208）、丹参（批号：190401077）、知母（批号：190501271）均购自河北春开制药股份有限公司，经天津中医药大学刘二伟副研究员鉴定为正品。按1∶2∶2∶1比例分别称取补骨脂、杜仲、丹参、知母，混合均匀后，加入70%乙醇加热回流提取，减压浓缩，烘箱干燥，DZQE的提取物得率30.38%。用0.9%氯化钠（NaCl）溶解稀释药物，配取100 mg/mL的DZQE提取物备用。
1.3 试剂NaCl、氯化钾（KCl）、七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、碳酸氢钠（NaHCO3）、葡萄糖（Glucose）、氯化钙（CaCl2）、水合氯醛购自天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.4 仪器Power lab生理记录仪（澳大利亚ADInstruments公司，Power lab/8sp）、张力传感器（澳大利亚ADInstruments公司，ML305）、离体组织浴槽（澳大利亚ADInstruments公司，Radnoti）、恒温器（澳大利亚ADInstruments公司，HEATER PUMP 170051A）。
2 方法 2.1 膀胱灌流法5%水合氯醛（0.6 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，沿腹中线打开腹腔暴露膀胱。由膀胱顶部插入静脉留置针，通过三通阀与微量灌注泵相连，信号通过四通道张力传感器于Power lab/8sp生理记录仪采集并记录。排空膀胱，数据记录前将膀胱内压力设置为0。用大鼠肢体反应麻醉评分法评定大鼠的麻醉深度，大鼠脱离深度麻醉状态后，0.9%NaCl溶液（空白组）或10 mg/mL的DZQE（DZQE组）通过微量输液泵缓慢向膀胱内灌注（0.17 mL/min），至大鼠尿道口出现尿液时停止。待大鼠排尿结束，膀胱内压力稳定时，记录并计算最大排尿压（MVP）、逼尿肌漏尿点压（DLPP）、膀胱顺应性（BC）、排尿时间（VT）、排尿量（UV）、膀胱测压最大容量（MCC）、排尿效率（EV），每只大鼠至少连续记录3次排尿过程。
2.2 逼尿肌条的制备取出膀胱，置于4 ℃预冷、95%氧气（O2）预饱和的K-H液（NaCl 6.9 g、KCl 0.35 g、MgSO4·7H2O 0.295 g、KH2PO4 0.16 g、NaHCO3 2.1 g、Glucose 2 g、CaCl2 0.275 g溶于1 L纯水）中，沿肌纤维走行方向切取4条纵行肌条（6 mm×2 mm），两端结扎并置于盛有37 ℃恒温K-H液的组织浴槽中，固定在浴槽底部后，另一端与肌肉张力换能器相连，持续供给95%O2和5%CO2的混合气体，Power lab/8sp生物信号处理系统记录肌条的收缩活动。初始时，大鼠离体膀胱逼尿肌肌条每15 min依次增加0.5 g张力至1 g基础张力，在离体组织浴槽孵育40~60 min，每15 min更换1次37 ℃新鲜K-H液，待肌条张力平稳后加入药物。
2.3 逼尿肌肌条的加药处理 2.3.1 逼尿肌肌条的收缩记录待肌条自发活动平稳后，在离体浴槽的K-H液中加入100 mg/mL的DZQE，使其终浓度达到12 mg/mL，记录肌条活动。
2.3.2 逼尿肌肌条的舒张记录待肌条自发活动平稳后，在离体浴槽的K-H液中加入1 mol/L的KCl（终浓度120 mmol/L），肌条收缩达到平台期后，加入100 mg/mL的DZQE（终浓度12 mg/mL），记录肌条张力变化。舒张率计算方式如下：舒张率=[（加药前张力-加药后张力）/（加药前张力-基础张力）]×100%。
2.4 DZQE活性成分筛选DZQE由补骨脂、杜仲、丹参、知母组成。本研究使用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索杜仲、丹参、知母的活性成分，使用中医百科全书（ETCM）检索补骨脂的活性成分。TCMSP中筛选条件为药物动力学参数ADME中口服生物利用度（OB）≥ 30%和类药性（DL）≥ 0.18，ETCM中筛选条件为类药性分级中的moderate与good，合并筛选得到DZQE中活性较高的成分，建立DZQE活性化合物数据库。
2.5 DZQE活性成分的靶点预测采用TCMSP数据库预测DZQE中活性成分的作用靶点，删除无靶点的活性成分及重复出现的靶点，利用蛋白质数据库Uniprot检索、筛选出的靶点得到标准靶点基因。
2.6 LUTS的疾病相关靶点筛选通过GeneCards数据库（以大于相关度的5次中位数为标准删选）和DisGeNET数据库，以“Lower Urinary Tract Symptoms” “LUTS”为关键词，挖掘LUTS相关靶点信息。
2.7 活性成分作用疾病的潜在作用靶点筛选利用Venny2.1将预测获得的成分靶点与疾病靶点映射，制作Venn图，获得DZQE影响LUTS的潜在作用靶点。
2.8 “中药-成分-靶点”网络构建将得到的潜在作用靶点一一对应DZQE的活性成分，得到DZQE在LUTS中可能起作用的活性化合物，建立对应关系，导入Cytoscape Version3.7.1软件，构建“中药-成分-靶点”网络。
2.9 潜在作用靶点的类型归属将潜在作用靶点依次导入DisGeNET数据库进行检索并整合获得靶点类型信息。
2.10 基因本体论（GO）分析和京都基因与基因组百科全书通路富集分析（KEGG）将上述的共同靶点导入DAVID 6.8数据库，GENE名称设置OFFICIAL GENE SYMBOL，限定物种为智人，进行GO分析和KEGG通路分析，保存结果。设定阈值P < 0.05，并按照涉及的靶点数目进行排序，筛选排名靠前的生物过程或通路。GO分析主要描述靶点的基因功能，包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）3个方面。KEGG分析获得DZQE和LUTS共同靶点所富集的信号通路。
2.11 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用两独立样本t检验，组内比较采用配对t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结果 3.1 DZQE降低大鼠膀胱DLPP和MVPDLPP是指在膀胱充盈过程中，膀胱腔内压增高超过尿道压或尿道阻力，尿液漏出时记录的压力，反映了膀胱出口阻力。MVP是指在排尿过程中的最大膀胱压力。膀胱灌流实验结果显示，加入DZQE后，DLPP与MVP降低，其中DLPP由（20.914 2±6.961 4）mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa，下同）下降至（15.231 0±6.641 3）mmHg，MVP由（19.122 7±4.972 8）mmHg下降至（13.490 9±5.457 5）mmHg，差异有统计学意义（P < 0.01）。
BC是在膀胱充盈过程中膀胱容量与压力改变的比值，反映了膀胱壁弹性；VT即单次排尿持续的时间；UV即单次排尿过程中排出的尿液体积；MCC为在膀胱灌注过程中，从前一次排尿结束经过膀胱充盈过程到下次排尿前的灌注液体体积，以灌注时间×灌注速度统计；EV是UV与MCC的比值。结果显示，灌流DZQE可轻微降低UV和MCC，提升BC、VT和EV，但差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。
DZQE促进大鼠膀胱逼尿肌收缩，抑制KCl诱导的大鼠膀胱逼尿肌过度收缩，呈现双向调节作用。加入DZQE后，膀胱逼尿肌收缩力增加，由（1.18±0.14）g上升至（1.80±0.25）g，差异有统计学意义（P < 0.01）。经KCl刺激可以诱导膀胱逼尿肌收缩，补充加入DZQE后，KCl诱导的逼尿肌收缩作用得到抑制，舒张率由（32.45±13.58）%上升至（63.19±18.44）%，差异有统计学意义（P < 0.05），提示DZQE对大鼠膀胱逼尿肌的舒缩作用呈现双向调节。见图 1。
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| 注：A.DZQE促进大鼠膀胱逼尿肌收缩，B.DZQE抑制KCl诱导的逼尿肌过度收缩；与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。 图 1 DZQE对大鼠膀胱逼尿肌舒缩作用的影响（x±s，n=6） |
通过在TCMSP及ETCM平台检索得到DZQE已报道的化学成分，根据设置的筛选调节，经整合共获得DZQE化学成分105个，其中杜仲25个、补骨脂9个、丹参59个、知母12个，其中补骨脂与知母有1个共同化合物，杜仲与丹参、知母各有1个共同化合物，去除重复化合物得到102个化学成分。逐一检索DZQE中102个化学成分的对应靶点，删去重复得到258个活性成分预测靶点。利用Cytoscape_v3.7.1软件构建DZQE活性化合物-预测靶点网络，共包含364个节点（4味中药、102个活性成分、258个靶点）、1 710条边（图 2）。其中，八边形代表中药，三角形代表化合物，方形代表靶点。
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| 时间（min） 图 2 DZQE活性化合物-预测靶点网络 |
检索GeneCards数据库和DisGenet数据库，得到LUTS相关疾病靶点246个。将活性成分预测靶点与LUTS疾病靶点映射，得到47个DZQE影响LUTS的相关靶点（图 3、表 2）。将47个共同作用靶点依次输入DisGeNET数据库，寻找对应靶点的类型信息。结果表明，DZQE抑制LUTS的作用靶点主要包括信号分子、转录因子、G-蛋白偶联受体、核受体、转运蛋白、酶、酶调节剂、激酶等物质（表 3）。
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| 图 3 疾病靶点-药物靶点Venn图 |
将得到的共同作用靶点一一对应DZQE的活性化合物，导入Cytoscape_v3.7.1软件，构建“中药-成分-靶点”网络（图 4）。该网络包括110个节点（4味中药、59个活性成分、47个靶点）、281条相互关系。
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| 注：八边形代表中药，三角形代表化合物，方形代表共同靶点基因。 图 4 “中药-成分-靶点”网络 |
将“3.4”项获得的47个共同作用靶点导入DAVID6.8数据库进行GO分析和KEGG信号通路分析。结果显示，DZQE影响LUTS的BP涉及308条（P < 0.05），主要富集在信号传导、平滑肌收缩、细胞增殖、血管收缩的正调节、MAPK级联、雌激素应答、蛋白质磷酸化的正调控、老化等方面。CC涉及35处（P < 0.05），主要富集在细胞质、细胞外间隙、蛋白质复合物、细胞微囊、胞浆、细胞核、线粒体等处。MF涉及50个（P < 0.05），主要富集在酶结合、蛋白结合、转录因子结合、类固醇激素受体活性、细胞因子活性等。选取GO功能各部分排名靠前的项目构建柱状图进行展示（图 5）。DZQE抑制LUTS的KEGG信号通路共确定88条信号通路（P < 0.05），筛选排名靠前的12条通路进行展示（表 4）。结果显示，DZQE抑制LUTS可能通过磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKt）、甲状腺激素、钙离子、雌激素、肿瘤坏死因子（TNF）、ErbB、MAPK、转化生长因子β（TGF-β）信号通路等发挥作用。
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| 图 5 GO富集分析 |
中医认为LUTS属于“癃闭”“精癃”范畴，治疗时常采用滋肾化气法、温补脾肾法、散瘀行水法、塞因塞用法、提壶揭盖法等[38]。《中医方剂大辞典》记载治疗癃闭的方剂211首，涉及中药182味[39]。目前尚无报道发现DZQE可用于LUTS的治疗。本研究首次发现DZQE可以改善大鼠膀胱的MVP及DLPP，并具有双向调节膀胱逼尿肌的舒缩作用，提示其具有改善LUTS的潜在作用。
由于男性与女性的下尿路结构不同，LUTS的病因病机也不尽相同。女性下尿路短且直，下尿路发病多与感染、妊娠等相关，治疗主要针对抗感染、恢复盆底肌功能等[40]。男性LUTS的发生可由前列腺增生压迫膀胱颈、尿道等引起，治疗多针对缩小前列腺体积、缓解平滑肌压力[41]。这意味着LUTS的研究需要根据性别区别对待。本研究中使用雄鼠研究DZQE对膀胱排尿功能的影响，大鼠排尿参数中的DLPP反映了膀胱出口阻力。随着膀胱出口阻力的增加，为顺利排出尿液，膀胱内压升高，久而导致逼尿肌承受超过正常的生理负荷而发生结构及功能上的改变。本研究通过膀胱灌流法检测大鼠的膀胱功能，结果表明，DZQE降低雄鼠排尿参数中DLPP和MVP，反映了DZQE可以作用于膀胱，降低雄鼠排尿时膀胱的出口阻力，减小膀胱内压对逼尿肌的压迫。离体肌条张力检测结果显示，DZQE可以直接促进逼尿肌的收缩，同时DZQE还可以抑制KCl引起的逼尿肌过度收缩，呈双向调节作用。在老年男性由前列腺增生压迫尿道引起LUTS的发展过程中，起初为了抵抗增大的腺体对尿道出口的压迫而排出尿液，膀胱壁代偿性增厚，膀胱内压升高，多表现为尿频、尿急、夜尿增多、急迫性尿失禁等。待膀胱逼尿肌持久保持过度收缩而失代偿后，弹性欠佳，张力降低，膀胱内压无法达到对抗压迫的阻力而顺利排出尿液，临床常表现尿等待、尿线分叉、排尿时间延长、尿线变细、尿无力、尿不尽感等，甚则导致上尿路损害[42-43]。这两个时期分别对应了膀胱过度收缩导致的压力增加和膀胱收缩无力导致的压力降低，寻找双向调节膀胱舒缩功能的药物具有重要意义。后续可分别通过建立模拟膀胱代偿期与失代偿期的两个模型，如前列腺增生模型及膀胱梗阻模型，进一步研究DZQE对BPH伴随LUTS的抑制作用。
进一步通过网络药理学预测DZQE改善LUTS可能的物质基础和作用机制。构建的DZQE活性化合物数据库共含102个化合物，包括补骨脂酚、丹参酮ⅡA、槲皮素、山奈酚、丹参酮Ⅰ、β-胡萝卜素、黄芪素、丁香脂素、亚油酸等，其中具有治疗LUTS活性的潜在化合物有59个，包括补骨脂活性成分新补骨脂素查尔酮等3个，知母中的豆甾醇、脱水淫羊藿素、薯蓣皂素等5个，杜仲中的桉脂素、丁香黄素、β-谷甾醇、β-胡萝卜素、山奈酚、槲皮素等16个，丹参中的木犀草素、丹参新醌、鼠尾草酚酮、二氢丹参内酯等35个。有研究显示，槲皮素可以增加血管平滑肌细胞（VSMC）中的超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低活性氧（ROS）水平和Toll样受体4（TLR4）表达，抑制其钙化[44]。还可以改善膀胱过度活动大鼠的红细胞能量分布[45]。山奈酚亦可抑制KCl引起的膀胱过度活动[46]。2011年1项对波士顿地区的1 000多名男性微量营养素的调查发现，摄入β-胡萝卜素可以降低40%~50%的LUTS发生率[47]。木犀草素可以通过抑制TGFBR1-Smad2/3磷酸化，抑制VSMC的增殖和迁移[48]，还可以抑制小鼠的L型钙通道抑制结肠平滑肌运动[49]。丹参酮ⅡA能够下降脊髓损伤大鼠排尿MVP与排尿阈值压，增大UV，提升EV，改善下尿路功能障碍后的功能恢复[50]。结合已有的研究和网络药理学分析，推测DZQE中抑制LUTS的活性成分可能更多来源于丹参和杜仲。
GO富集分析显示DZQE治疗LUTS的生物学过程涉及平滑肌收缩、血管收缩、MAPK级联、雌激素应答、蛋白质磷酸化、老化等。此外，KEGG富集分析结果显示，DZQE治疗LUTS可以通过PI3K/Akt、甲状腺激素、钙离子、雌激素、TNF、ErbB、MAPK、TGF-β等信号通路发挥作用。已有研究表明，平滑肌收缩依赖于钙离子-肌纤凝蛋白系统，肌浆内钙离子的浓度水平与平滑肌舒缩反应密切相关[51]。丹参酮ⅡA、槲皮素、补骨脂乙素、知母皂苷AⅢ等多种成分均可参与钙离子通道（SOCCs）的开关调节[52-53]。雌激素在调节平滑肌功能中亦具有重要作用，可调节小电导钙激活钾通道（SK3）[54-55]，还可影响肌球蛋白重链（MHC）前mRNA的3’末端的选择性剪接，增加SM1与SM2的比例，抑制去势后逼尿肌中MHC的减少[56]。DZQE方中雌激素活性成分的筛选鉴定研究显示，补骨脂酚、补骨脂素、β-谷甾醇、槲皮素、丹参酮ⅡA、豆甾醇等均具有植物雌激素活性[57-61]。由此，推测DZQE可通过调节钙离子浓度或（且）雌激素通路发挥调节膀胱平滑肌舒缩的作用。
本研究基于器官水平实验和网络药理学分析，首次证实DZQE可以调节雄性大鼠膀胱排尿功能，同时预测了DZQE抑制LUTS作用的活性成分和候选靶点，为后续开展实验研究提供了研究方向，也为其临床应用提供了理论支持。
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