旋覆花为菊科植物旋覆花Inula japonica Thunb.或欧亚旋覆花Inula britannica L.的花序，味苦、辛、性微温，具有降气、消痰、行水、止呕的作用^[1]，可用于治疗风寒咳嗽、痰饮蓄结、胸膈痞闷、咳嗽痰多等^[2-3]。在中国药典中，常通过性状鉴别、薄层鉴别和醇溶性浸出物等方法对旋覆花进行质量评价。旋覆花分布广泛^[4]，在中国北部、东北部、中部和东部各省都有分布，是药典规定的入药品种，然而目前有其它旋覆花品种也被用作销售与入药，其中水朝阳旋覆花Inula helianthus-aquatica C. Y. Wu ex Ling是市场上的一种非药典规定品种。为了保证可靠的治疗效果，有必要对旋覆花和水朝阳旋覆花做出区分从而规范其用药现状。

现代分析技术的飞速发展使得中药的质量评价方法不再受限于传统技术与仪器^[5-7]。大部分中药的化学成分复杂且种类较多^[8]，因此需要更加快速、简便的方法在短时间内完成中药的物质基础分析。超高效液相色谱（UPLC）具有分析时间短、检测灵敏度高、分离效能高等优点。而中药色谱指纹图谱是指对中药进行一定的处理后，通过特定的分析技术，得到具有其化学特征的色谱图，能够实现化学成分识别和多成分定量分析^[9-10]，目前已得到了广泛的应用。基于所建立的指纹图谱，还可借助主成分分析（PCA）^[11]、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）^[12]等多种统计分析方法进行对不同产地、不同加工方法的中药产品进行化学模式识别，定位到潜在差异物质，进一步完善其质量评价体系^[13]。该研究建立了旋覆花和水朝阳旋覆花的UPLC指纹图谱，并结合化学计量法，借助OPLS-DA模型筛选两类旋覆花的鉴别标志物，以期为旋覆花的质量评价方法提供参考。

1 仪器与材料 1.1 仪器

Agilent 1290 UPLC色谱仪（美国Agilent公司）；多功能高速粉碎机（永康市追梦家居有限公司）；BP121S型万分之一天平（德国Sartorius公司）；MSA225P-0CE-DU型十万分之一天平（德国Sartorius公司）；5430R型离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 试药

对照品1，5-二咖啡酰奎宁酸（纯度99%）、异槲皮苷（纯度98.62%）、绿原酸（纯度≥ 98%）、木犀草素（纯度98.5%）、槲皮素（≥98%）、花旗松素（≥ 98%）购自于成都德斯特生物科技有限公司；对照品1，3-二咖啡酰奎宁酸（纯度≥ 98%）、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（纯度≥ 98%）、金丝桃苷（纯度98.5%）购自于成都曼斯特生物科技有限公司。各对照品结构如图 1所示。甲醇、乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；甲酸（色谱纯，美国Anaqua^TM Chemicals Supply公司）；超纯水由Millipore超纯水系统制备。

1.3 药材

所用27批样品（X1~X27）为菊科植物旋覆花Inula japonica Thunb. 的干燥头状花序，18批样品（Y1~Y18）为菊科植物水朝阳旋覆花Inula helianthus-aquatica C. Y. Wu ex Ling的干燥头状花序，均由天津中医药大学常艳旭教授、张坚副教授鉴定，其具体来源见表 1，样品储存于天津中医药大学中医药研究院D楼。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈（B）；流速：0.3 mL/min；进样体积：2 μL；检测波长：254 nm；梯度洗脱，洗脱梯度如表 2所示：

2.2 供试品溶液的制备

精密称取各批次药材粉末0.25 g，加入75%甲醇5 mL，以500 W功率超声提取45 min，补足失质量后，在10 000 rpm下离心5 min（离心半径为15.6 cm），取上清液，用0.22 μm的有机滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液，储存于4 ℃冰箱中备用。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、花旗松素、金丝桃苷、异槲皮苷、1，5-二咖啡酰奎宁酸、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、木犀草素各对照品适量，加入甲醇，配制为2 mg/mL的对照品溶液，置于4 ℃冰箱备用。

2.4 方法学考察 2.4.1 精密度实验

取X18批次样品，精密称定，按“2.2”项方法制备样品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样6次，记录色谱图，以9个化合物色谱峰保留时间及峰面积计算其RSD值，结果见表 3，其RSD值均小于5%。表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性实验

取X18批次样品6份，精密称定，按“2.2”项方法制备方法，平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样，记录色谱图，以9个化合物色谱峰保留时间及峰面积计算其RSD值，结果见表 3，其RSD值均小于5%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性实验

取X18批次样品，精密称定，按“2.2”项方法制备样品溶液，按“2.1”项色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样，记录色谱图，以9个化合物的色谱峰保留时间及峰面积计算其RSD值，结果见表 3，其RSD值均小于5%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 指纹图谱建立与相似度评价

取各批次药材粉末，按“2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件分别进样，记录色谱图，分别将各批次药材UPLC色谱图以AIA格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行数据分析。以X8样品的指纹图谱为参照图谱，采用中位数法，经过共有峰匹配及多点校正，得到45批样品的指纹图谱。如图 2所示，X1~X27为旋覆花，Y1~Y18为水朝阳旋覆花。45批样品共标定了30个共有峰，通过与对照品比对指认出9个化学成分，分别为绿原酸（2号峰）、1，3-二咖啡酰奎宁酸（9号峰）、花旗松素（10号峰）、金丝桃苷（12号峰）、异槲皮苷（14号峰）、1，5-二咖啡酰奎宁酸（19号峰）、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（21号峰）、槲皮素（23号峰）、木犀草素（24号峰）。分别将旋覆花和水朝阳旋覆花谱图导入软件，生成各自的对照指纹图谱，旋覆花与水朝阳旋覆花的对照指纹图谱见图 3。

对各批次样品分别进行相似度分析，从谱图上看，两类旋覆花的色谱峰差异并不大，说明两类旋覆花化学成分种类具有高度的相似性，但是有些峰面积存在较大差异，如14、23、24号峰等，RX中这些峰的面积远大于RY，表明两类旋覆花的一些化学成分含量存在较大差异；相似度结果见表 4，各批次药材与各自对照图谱的相似度评价结果均在0.9以上，表明市场上同一品种，不同批次间旋覆花的质量比较相似、稳定。

2.6 定量分析 2.6.1 线性关系考察

按“2.3”项方法制备对照品溶液，精密量取各储备液适量，配置为9个化合物一系列浓度梯度的混合对照品溶液，按“2.1”项色谱条件进样，以溶液浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制含量测定的标准曲线，计算线性回归方程，结果见表 5，9个化合物的相关系数均大于0.999，表明9个化合物在各自的浓度范围内线性关系良好。

2.6.2 加样回收率实验

精密称取Y1样品6份，每份125 mg，精密加入等量的对照品，按“2.2”项方法平行制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样，测定9个化合物的回收率，结果见表 5，各化合物的加样回收率在95.08%~104.82%之间，RSD值均小于5%，表明定量分析方法准确、可靠。

2.6.3 定量分析结果

按“2.1”项色谱条件进样，测定各批次药材中绿原酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、花旗松素、金丝桃苷、异槲皮苷、1，5-二咖啡酰奎宁酸、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、木犀草素的含量，结果如表 6所示，a、b、c、d、e、f、g、h、i分别代表绿原酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、花旗松素、金丝桃苷、异槲皮苷、1，5-二咖啡酰奎宁酸、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、木犀草素，可以看出各化合物含量在不同批次样品中有明显差异，1，5-二咖啡酰奎宁酸含量最高，绿原酸含量也相对较高。

2.7 多元统计分析 2.7.1 鉴别标志物筛选

PCA是一种无监督分类模式的统计方法，可以观察不同样本在自然情况下的分类属性^[14]。将45批次样品的共有峰数据导入SIMCA-P做PCA分析，结果如图 4所示，45批样品绝大部分批次都可以分为两类，旋覆花（X）与水朝阳旋覆花（Y）可以各自聚为一类（R²X=0.822，Q²=0.657），表明这两类旋覆花存在一定的差异。OPLS-DA是一种有监督的判别模式统计方法，可以将所有样本按照一定方式分为两组。利用OPLS-DA分析，将27批旋覆花（X）和18批水朝阳旋覆花（Y）分为两组，分组结果如图 5所示，红色样本代表旋覆花（X），蓝色样本代表水朝阳旋覆花（Y），可以看出这两类旋覆花可以各自聚为一类，且拟合度和预测度良好（R²X=0.933，R²Y=0.948，Q²=0.904），表明其分组准确、可靠。

基于所建立的OPLS-DA模型，得到每一个共有峰的VIP值，结果如图 6所示。为了进一步找到能够区分两类旋覆花的鉴别标志物，筛选出VIP值大于1的共有峰共有10个，即为能够区分旋覆花和水朝阳旋覆花的色谱峰^[15]，其中包含6个化合物，分别为1，5-二咖啡酰奎宁酸、槲皮素、异槲皮苷、木犀草素、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷和绿原酸，结果如表 7所示，这些化合物可以作为鉴别旋覆花和水朝阳旋覆花的潜在标志物。

2.7.2 判别分析

为了建立旋覆花（X）和水朝阳旋覆花（Y）的预测模型，根据6个潜在鉴别标志物的含量，采用SPSS软件对45批样品建立了Fisher判别模型。选取15批旋覆花（X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15）和15批水朝阳旋覆花（Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15）作为训练集，剩余样本作为测试集，建立判别模型，得到的判别分析公式如下：Y=2.906 X1+4.183 X2-1.021 X3-7.844 X4+7.379 X5+2.918 X6-1.167（X1为绿原酸；X2为异槲皮苷；X3为1，5-二咖啡酰奎宁酸；X4为异鼠李素-3-O-葡萄糖苷；X5为槲皮素；X6为木犀草素）。分类结果表明原始分组中100%的样本可以进行正确分组，测试组中100%的样本可进行正确分组，证明该判别分析模型准确可靠。因此，对于两类旋覆花中的未知样品，可以通过测定6个鉴别标志物的含量，将其代入判别公式，当计算结果大于临界值0（3.266与-3.266的平均值）时，该未知样品被判定为旋覆花。

此外，6个标志物含量在两类旋覆花中存在较大差异，尤其是异槲皮苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素和木犀草素这4个化合物含量差异较为明显。同时，进一步探讨了6个标志物对两类旋覆花的鉴别能力，将6个化合物的峰面积导入SIMCA-P进行OPLS-DA分析。结果如图 7所示，旋覆花和水朝阳旋覆花可以明显区分，表明所筛选的6个鉴别标志物可以达到从化学成分角度区分两类旋覆花的目的。

3 讨论

HPLC具有分离效能高、检测灵敏度高和应用范围广等特点，中药成分绝大多数可在HPLC上进行分析检测，因此成为中药指纹图谱技术的首选方法。但与HPLC相比，UPLC具有更快的分析速度、高分辨率、窄峰宽和较少的溶剂消耗^[16]，可同时分离数百种成分^[17]。如宋青坡等^[18]采用UPLC和HPLC对比检测金银花药材中木犀草苷的含量，优化测定金银花中木犀草苷含量的方法，结果显示2种检测方法均可准确定量分析木犀草苷含量，但UPLC法得到的加样回收率高于HPLC法，RSD值也低于HPLC法，两者相比，UPLC法更灵敏快捷，适合大量样品检测。因此UPLC技术能够构建更全面的中药指纹图谱，适用于大规模药材批次的质量监控和黄酮等微量有效成分的检测，进而借助建立的指纹图谱更加全面、快速、准确地表征中药的化学成分^[19]，为中药质量控制、标准化和国际化提供强有力的技术支持。本研究针对目前市场中旋覆花与水朝阳旋覆花混淆的问题，提出了一种UPLC指纹图谱结合化学计量学的方法，筛选可用于区分旋覆花和水朝阳旋覆花的鉴别标志物。建立了旋覆花和水朝阳旋覆花的指纹图谱，一共指认出9个化学成分，并对其进行定量分析，定量限低至0.02 μg/mL，可准确检测到含量小于0.1 mg/g的微量成分；方法学考察结果显示9个化合物的相关系数均大于0.999、加样回收率均大于95%，精密度、重复性和稳定性都在合格范围内，符合2020版《中国药典》相关规定，表明该方法操作简单有效、稳定可靠。

旋覆花与水朝阳旋覆花虽然同属菊科，但在功效、成分含量及临床应用上存在显著差异。如同样性温，旋覆花以降气化痰、降逆止呕为主，主治痰饮蓄结、咳喘痰多、胸膈痞满、呕吐噫气等症，偏于温化痰饮，适用于寒痰或湿痰壅滞等病症。而水朝阳旋覆花以清热解表、止咳平喘为主，偏于清热化痰。黄火强等^[20]、耿红梅等^[21]的研究显示水朝阳旋覆花的化学成分以倍半萜内酯类为主^[22]，黄酮类成分含量较低，未见重点报道；而旋覆花中总黄酮含量较高，如槲皮素在部分提取物中占比可达0.012%。与该文旋覆花中异槲皮苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素和木犀草素含量显著高于水朝阳旋覆花的分析结果较为吻合。因此本研究主要以黄酮类化合物作为旋覆花和水朝阳旋覆花的鉴别标志物具有较高的可行性和说服力。

此外，旋覆花与水朝阳旋覆花的成分含量和功效主治差异可能与其不同的生长环境有关，旋覆花广泛分布于东北和华北等温带地区，如黑龙江和河北北部，由于位于长江以北，气候干燥，光照强，昼夜温差较大，其土壤通常含有CaCO₃，使得pH呈中性至微碱性，因此植物根系易吸收土壤溶液和土壤胶粒上吸附的Ca²⁺、Mg²⁺和K⁺，进而调控次生代谢酶活性，促进了黄酮类成分的合成，具有抑菌、抗炎作用。水朝阳旋覆花则主要产于云南和四川等地区，海拔通常较高，气候温暖潮湿，如四川的年均温度在12~20 ℃之间，日温≥10 ℃的持续期长达240~280 d，且气温日差较小。余翠翠等^[23]认为环境温度升高能促进大部分挥发性萜类化合物产量，如倍半萜内酯；同时，较长时间的光照和强紫外线也能够促进萜类化合物合成，因此水朝阳旋覆花具有较强的抑制癌细胞增殖作用。而市场上旋覆花和水朝阳旋覆花混淆的现状可能造成误用、滥用甚至产生不良影响的后果，对临床疗效和药材质量标准化进程带来负面影响。因此，通过化学成分含量鉴定两种旋覆花，能够避免混淆使用，确保其药材质量和临床疗效，为旋覆花的质量标准制定提供科学依据。

4 小结

本研究建立了市场中27批旋覆花样品和18批水朝阳旋覆花样品的UPLC指纹图谱，通过指认共有化学成分，量化了两种旋覆花中化学成分含量的差异，并借助化学计量学方法，如OPLS-DA、判别分析等，筛选出6个化学成分作为两类旋覆花的鉴别标志物，分别为绿原酸、异槲皮苷、1，5-二咖啡酰奎宁酸、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素和木犀草素。该方法专属性强，稳定准确，能够为建立两种旋覆花的特征指纹图谱建立数据支持，为旋覆花质量标准体系的建立提供了一定的参考意义。此外，本研究虽筛选出6个鉴别标志物，但仍存在以下问题：首先，实验X1~X27批次样品中缺少来源于东北部的旋覆花样本，未能全面反映不同地理环境对化学成分的影响；其次，该指纹图谱的长期稳定性和批次间重复性仍需更长时间跨度的数据验证。未来可从扩大产地范围、纳入不同采收期和不同储存条件下的样品，并建立两种旋覆花的动态化学特征数据库等方面进一步研究，以期为旋覆花药材品质的监控提供理论依据。